【技術(shù)干貨】PCR實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的 DNA 大幅增加。
 
我們進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，經(jīng)常會(huì)不定的出現(xiàn)一些異常問(wèn)題，那么遇到這些問(wèn)題該怎么解決呢？接下來(lái)跟著遠(yuǎn)慕一起來(lái)看看前輩們的經(jīng)驗(yàn)。  
 
沒(méi)有 ct 值
檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有 Ct 值情況,排查是否有以下問(wèn)題:  
1.循環(huán)數(shù)不夠  (一般不超過(guò) 45 循環(huán)，不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));  
2.PCR 程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般 SG 法采用 72 ℃ 延伸時(shí)采集，TaqMan 法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào)，另外熒光采集是否選中。  
3.引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò) PAGE 電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;  
4.模板量可能降解或上樣量不足  (不超過(guò) 5 ng，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備，避免反復(fù)凍融;  
5.引物探針是否合適  (尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴(kuò)增基因組DNA；上下游引物 Tm 值超過(guò) 4 ℃ 以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。  
 
ct 值過(guò)晚
在相對(duì)定量中, Ct 值一般控制在 15 ~ 25 之間比較好，如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品，Ct 值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò) 4 循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。. 因此，判斷 Ct 值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。  
1.擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計(jì)不合理，需要重新設(shè)計(jì)；  
2.PCR 程序不合適  , 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度；退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)1s)；  
3.MgCl2 濃度不合適  ，增加鎂離子濃度等。PCR 各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；  
4.PCR 產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR 產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò) 5 bp；  
5.模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行 PCR 檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。
 
陰性對(duì)照擴(kuò)增有信號(hào)
陰性對(duì)照擴(kuò)增有信號(hào)排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng),造成交叉污染:
1.引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。  
2.引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。  
3.鎂離子濃度過(guò)高。適當(dāng)降低鎂離子濃度,或選擇更適合的 mix 試劑盒。  
4.模板有基因組的污染。RNA 提取過(guò)程中避免基因組 DNA 的引入,或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。  
5.交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染, 或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染, 建議對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行處理, 或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
 
標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳 R2 < .9，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題:
1.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣誤差  ,使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。
2.標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融,將高濃度 DNA 模板分裝,保存于 -2 ℃ 或 -8 ℃，現(xiàn)配現(xiàn)用。  
3.引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針。  
4.模板中存在抑制物。模板濃度過(guò)高,根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以 5 ~ 5 ng 為宜。
 
熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題:
1.引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物濃度不佳, 尤其是涉及二聚體存在時(shí), 適當(dāng)降低引物濃度, 并注意上下游引物的濃度比例;  
2.模板有基因組污染。RNA 提取過(guò)程中避免基因組 DNA 的引入, 或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。  
3.離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度, 或選擇更適合的 mix 試劑盒, 不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合, 有些情況下可以通過(guò)更換試劑盒改善結(jié)果。
 
擴(kuò)增曲線異常
遇到擴(kuò)增曲線異常，比如 S 型曲線等等情況,有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：
1.模板的濃度太高或者降解。
2.熒光染料的降解。  
3.人為污染。在操作熒光定量 PCR 時(shí)，帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等。  
4.液體揮發(fā)。耗材氣密性等問(wèn)題引起液體蒸發(fā),沒(méi)有很好的聚集在管子里;  
5.氣泡。操作問(wèn)題如移液槍加樣引起的氣泡問(wèn)題。
 
擴(kuò)增效率低
該情況適用于針對(duì)所有的基因,特別是內(nèi)參基因仍無(wú)法獲得較好的擴(kuò)增信號(hào)時(shí),應(yīng)考慮如下情況:
1.反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解。  
2.反應(yīng)條件不夠優(yōu)化?？蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法,適當(dāng)延長(zhǎng)變性退火時(shí)間。  
3.反應(yīng)體系中有 PCR 反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入的,應(yīng)先把模板適度稀釋?zhuān)偌尤敕磻?yīng)體系，減少抑制物的影響。
 
其他原因
模板反復(fù)凍融、模板長(zhǎng)時(shí)間在紫外光下照射導(dǎo)致的模板發(fā)生突變；基因序列與 NCBI 上的不一致。
 
今天的講解就到這里啦，關(guān)于PCR的這些小陷阱你了解了嗎？如果有其他實(shí)驗(yàn)相關(guān)的問(wèn)題也可以咨詢我們遠(yuǎn)慕生物技術(shù)人員哦~