免疫球蛋白提取技術(shù)：IgG的分離與提純

免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表著機(jī)體體液免疫的水平，并進(jìn)一步代表著B(niǎo)細(xì)胞的功能，因此測(cè)定血清Ig含量可以推知機(jī)體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過(guò)高和過(guò)低。

隨著免疫學(xué)的發(fā)展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為必不可少的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數(shù)采用二步法以上相結(jié)合的方法，特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A(chǔ)，再經(jīng)過(guò)層析柱的方法來(lái)提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。

硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來(lái)（稱為鹽析）。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同，利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提，為了獲得純化的免疫球蛋白成分，必須進(jìn)一步采用層析的方法進(jìn)行分離。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。 ???????
 IgG的分離與提純

（一）材料與試劑配制
1．動(dòng)物血清
2．硫酸銨飽和溶液  硫酸銨 800g~850g  H2O 1 000ml  加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過(guò)濾，置室溫過(guò)夜，然后以28％NH4OH調(diào)pH至7.0（不調(diào)pH值也可以）。
注：硫酸銨以質(zhì)量?jī)?yōu)者為佳，因次品中含有少量重金屬對(duì)蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過(guò)夜后濾過(guò)，加熱蒸發(fā)H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB 液
4．1％BaCl2溶液
5．納氏液 HgI  115.00g  KI 80.00g  加H2O 至 500.00ml
溶化后過(guò)濾，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和 0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃紙）。

（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置 30min。
2．3 000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。
3．在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30ml，使成50％（(NH4)2SO4溶液，充分混合，靜置30min。
4．3 000r/min離心20min，棄上清。
5．于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液 10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。
6． 3 000r/min 離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2~3次。
7． 用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。
8． 透析除鹽，在常水中透析過(guò)夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次。以1％BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4+（取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH4+存在），直至無(wú) SO42-或NH4+出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
9． 離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．過(guò)DEAE－纖維素層析柱。（裝柱過(guò)程見(jiàn)層析技術(shù)）。以 0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白質(zhì)及其定量鑒定。
12．IgG的純度鑒定 可采用下列方法之一鑒定。