大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取及轉(zhuǎn)化

實驗概要
本實驗包括大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取，質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

實驗步驟
1. 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：
1) 接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。
2) 37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
3) 取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。
4) 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5) 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。
6) 加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。
7) 以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管
8) 加入等體積的異戊醇，混勻后于0℃靜置10min。
9) 再以10，000rpm離心20min，棄上清。
10) 用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。
11) 待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中

煮沸法：
1) 將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中，4℃下12000ｇ離心30秒。
2) 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3) 將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中，渦旋混勻。
4) 加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3秒鐘。
5) 將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。
6) 用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。
7) 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。
8) 取20ml進(jìn)行電泳檢查。

注意：
1) 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。
2) 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細(xì)菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
3) 提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA，但RNA并不干擾進(jìn)一步實驗，如限制性內(nèi)切酶消化，亞克隆及連接反應(yīng)等。

2. 質(zhì)粒DNA的大量提取和純化
在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA，為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

1) 堿法
A. 取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。
B. 將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。
C. 同步驟A方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。
D. 將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中，充分懸浮菌體細(xì)胞。
E. 加入12ml新配制的溶液II，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴10分鐘。
F. 加9ml用冰預(yù)冷的溶液III，搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘，此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。
G. 4℃下5000g離心15分鐘。
H. 取上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml)， 37℃水浴20分鐘。
I. 加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。
J. 取上層水相，加入等體積氯仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。
K. 取上層水相，加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000)，冰上放置60分鐘。
L. 4℃下12000g離心15分鐘，沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
M. 真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

注意：
1) 提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。
2) 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和，切忌劇烈振蕩。
3) 由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應(yīng)先對該酶液進(jìn)行熱處理(80℃ 1小時)，使DNA酶失活。

3. 質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定

4. 大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
感受態(tài)的細(xì)胞可以攝入外部溶液中的DNA，而常態(tài)的細(xì)胞卻不能，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進(jìn)入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞。
1) 取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2) 取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3。
3) 然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min。
4) 在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液。
5) 把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min。
6) 然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液。
7) 將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。

5. 質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌
制備好感受態(tài)細(xì)胞后，接下來就是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞的過程。但要注意的是感受態(tài)細(xì)胞最好是新制備的，因為保存一定時間的感受態(tài)細(xì)胞會使轉(zhuǎn)化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。

1) 取新制備的一管感受態(tài)細(xì)胞。
2) 取0．03ml感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)和4ng質(zhì)粒DNA混勻，置冰浴30min。
3) 將 Ep管置于42℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。
4) 在 Ep管中加70u1 LB培養(yǎng)基混勻，37℃培養(yǎng)30min。
5) 涂在含適當(dāng)濃度抗生素的LB平板上。
6) 37℃培養(yǎng)過夜，長出的菌斑既為陽性克隆。

6. 線形質(zhì)粒DNA 5'-粘性末端去磷酸
經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒DNA 5'端均帶有磷酸集團，如用此載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其自身環(huán)化幾率非常高，影響連接、轉(zhuǎn)化效率。因此一般酶切的質(zhì)粒DNA要經(jīng)脫磷，使用堿性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集團。方法如下：
1) 質(zhì)粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min。
2) 補充CIAP 再37℃水浴30min。
3) 加入50mM EDTA至終濃度5mM 75℃加熱10min 失活CIAP。
4) 冷卻至室溫，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮。
5) 抽干溶液，加適量TE溶解。