關(guān)于封閉液不得不說的這些事兒

最早的有關(guān)封閉的概念來源于免疫組化，1941年Albert Coons發(fā)表文章，采用一種封閉液可以消除抗體的非特異性結(jié)合。

原來，在免疫組化染色的過程中，發(fā)現(xiàn)有一些內(nèi)源性的生物素，酶等非特異性物質(zhì)干擾信號和增加背景，必須進行阻斷才能達到好的效果，這里有幾個英文詞來形容它的功能（blocking或quench）。

所謂的好的視覺效果就是指高的信噪比（S/N），也就是降低背景信號。常用的封閉液一般有正常血清，脫脂奶粉，BSA，明膠等。

進入分子生物學時代，出現(xiàn)了好幾個BLOT實驗，如western blot，northern blot 和southern blot，還有一個dot blot。在這些實驗中，無一例外地要使用到封閉液。

1984年，David. A Johnson給它命名為Blotto，起先我還認為這個詞是根據(jù)blot起的商品名，后來查了一下原文，才知道是一個很有意義的縮寫，叫做 (Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer)

這是一種不含有表面活性劑的封閉液，在western blot實驗中防止非特異性結(jié)合的效果比BSA和明膠要好，可以顯著降低檢測的背景。后來，許多公司都開發(fā)了自己的獨特封閉液的配方，并且商業(yè)化。目前市場上有很多商業(yè)化的封閉劑產(chǎn)品。 封閉劑的主要功能可以歸類為，
增強信噪比，
降低非特異性結(jié)合，
減少背景干擾，
穩(wěn)定蛋白增加靈敏度。
同時，還必須具備以下特征：
有效地阻斷檢測物質(zhì)與載體表面的非特異性結(jié)合；
不會阻礙試劑的包被；
具有穩(wěn)定固相結(jié)合的功能（防止變性）；
沒有酶的活性導致檢測信號的改變或者反應物的降解；
每一批次的高度穩(wěn)定。

從封閉劑的種類上來講，可以將封閉劑分為以下幾種：

1) 脫脂奶粉
首先是便宜易得，一般2.5-5% 濃度可用.但是，牛奶中含有一些磷酸化蛋白，因此，對于抗磷酸化的抗體不建議使用。
脫脂牛奶在western blot中是一種極為常見的封閉劑，效果相當?shù)暮谩Ｒ郧懊看蔚奖泵阑貋頃r，總不免帶幾公斤奶粉回來。和嬰兒無關(guān)，只是封閉！

2)小牛血清白蛋白
和脫脂牛奶一樣，小牛血清白蛋白也是一種很常見的封閉劑。BSA 一般配成濃度2-5%使用. 但是價格比較貴。

3) 明膠
明膠是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，就是一種短鏈的膠原蛋白，冷水魚皮中提取的的明膠在低溫下可以很好地保持液態(tài)，稀釋到 0.1-5%用于封閉。
與BSA或脫脂奶粉不同的是，明膠不含有血清成分，因此不會與哺乳動物的抗體發(fā)生交叉反應產(chǎn)生背景信號。
但是，明膠不太適合用于生物素放大系統(tǒng)的檢測，因為明膠含有內(nèi)源性的生物素，對檢測信號會產(chǎn)生干擾。

4) 正常血清 (如：胎牛，家兔，山羊血清等。)
所謂的正常，就是動物無疾病，沒有經(jīng)過免疫如疫苗等，全血清中含有大量蛋白，可以用于封閉，但是一般情況下我們用的很少，
因為，它的封閉效果與BSA和脫脂奶粉相比，沒有什么優(yōu)勢，而且血清也很貴，需要封閉的濃度也很高(~5-10%)。正常血清中含有大量的免疫球蛋白，會和哺乳類動物的抗體發(fā)生交叉反應。

5) 純化的酪蛋白
酪蛋白是從牛奶中提取的蛋白質(zhì)，是一種很老的封閉劑。著名的casein block現(xiàn)在還在廣泛使用。必須知道casein就是一種磷酸化蛋白，因此不能用于磷酸化的檢測。
單純的酪蛋白不太好溶解，一般都是以鈉鹽的形式使用。溶解后的溶液呈半透明狀態(tài)，好多人以為是污染后的渾濁，其實這只是一種錯覺而已。

6) 非蛋白類封閉劑
Polyvinylpyrrolidone (PVP)是一種非蛋白類的水溶性聚合物，也是一種常用的封閉劑?？梢越Y(jié)合NC膜或PVDF膜，與其它封閉劑聯(lián)合使用，起到封閉作用。
尤其對于小分子的檢測，大分子量的封閉劑的空間位阻，會影響小分子的結(jié)合。像PVP這樣的封閉劑有很多，比如PVA，S7，S9等表面活性劑。
尤其是在側(cè)向?qū)游霎a(chǎn)品中，應用相當廣泛。非蛋白類的封閉劑還包括糖類，蔗糖以及PEG也是一種很好的封閉劑，除了具有良好的封閉效果，還會起到穩(wěn)定蛋白的作用。

7）吐溫系列
談了這么長時間的封閉液，居然沒有提到吐溫。有點不應該。雖然它也屬于非蛋白類封閉劑，屬于聚合物，屬于表活，但是，作為封閉劑，必須單獨拿出來講。
吐溫在封閉劑當中，我覺得稱得起茶中大紅袍，酒中的拉菲。我們常用的PBST和TBST，后面那個大寫的T就是吐溫：Tween。
它真實的名字叫做Polysorbate Sorbitan ，中文叫做聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為Tween-20，60，40，80等。
吐溫的作用很強大，可以加在裂解液里溶解膜蛋白，可以加在結(jié)合液里用于穩(wěn)定蛋白，可以和BSA混合作為封閉液，關(guān)鍵的吐溫本身沒什么毒性，還可以作為食品添加劑。
每個學免疫的人，對于封閉的理解，基本上都是從Tween-20和BSA開始啟蒙的。

8) 商業(yè)化封閉液
一般情況下這些封閉液都含有一些神秘的蛋白和配方，再起一個響亮的名字：如SuperBlock。
可以推測其中不含磷酸化蛋白，不含有免疫球蛋白，不含白蛋白和生物素。還有一個特點就是封閉速度很快，讓你可以縮短實驗的時間。缺點就是很貴，一分錢一分貨。
既然話題是封閉液，不能單說封閉劑，還得談談溶液的部分。選擇什么樣的溶液？要根據(jù)自己的檢測要求來定。
最常見的是PBS或TBS，還有一些buffer比如碳酸鹽，硼酸鹽，都是堿性的緩沖液，醋酸鹽buffer屬于酸性的。
記住如果檢測磷酸化蛋白，或用于堿性磷酸酶系統(tǒng)，不要用PBS。具體的使用還得在實戰(zhàn)中進行摸索。
還有一類特殊的封閉劑屬于特殊的有針對性的的封閉，最著名的就是HAMA。

免疫分析中出現(xiàn)問題的一個常見原因是干擾性抗體，如眾所周知的人抗鼠抗體（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗動物抗體、嗜異性抗體（Id）或類風濕因子（rheumatoid factors，RF）。

一般來說，這些抗體干擾主要發(fā)生在夾心法的免疫分析中，即基于捕獲抗體和檢測抗體。干擾性抗體可以交聯(lián)捕獲抗體和檢測抗體，導致假陽性結(jié)果。
或者，它們可以阻止抗原與檢測抗體的結(jié)合，甚至引起檢測抗體的聚集，導致假陰性結(jié)果。由于這種封閉劑的針對性很強，一般情況下都稱之為“阻斷劑”，中文用詞講究。

在分子生物學實驗中還有一個常用的，也很奇葩的封閉劑，就是鮭魚的精子DNA。也不知道是誰先想出來的.......