干貨分享：探討 rRNA去除的方法與必要性

遺傳中心法則表明，DNA是生物體內(nèi)遺傳信息的載體。遺傳信息在精密的調(diào)控下從DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，再傳遞到蛋白質(zhì)。因此RNA被認(rèn)為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的“橋梁”，在研究轉(zhuǎn)錄組信息中占有著重大的作用。
背景介紹
轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指在某一特定的生理條件下，細(xì)胞、組織或者生物體內(nèi)所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，即轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA總和，包括編碼RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同類型的RNA分子。在這之中核糖體RNA (rRNA) 約占RNA總量的 80%，是最多的一類RNA，通常這類RNA分子量比較大且代謝不活躍，種類包括：原核生物中5S rRNAs、16S rRNAs和23S rRNAs三種，真核生物中5S rRNAs、5.8S rRNAs、18S rRNAs和28S rRNAs四種。

圖1：RNA分類圖
rRNA的“作用”
隨著人類基因組計劃（HGP）和DNA元件百科全書計劃（ENCODE）的完成，人們發(fā)現(xiàn)在人類基因組中大部分DNA都可以轉(zhuǎn)錄成RNA，但是僅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白質(zhì)的編碼，剩余不編碼蛋白質(zhì)的的非編碼RNA（ncRNA），被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄噪音。這種轉(zhuǎn)錄組噪音（無效信息）基本全部來源于豐度最高的成員——rRNA。


測序的目的就是為了更多的獲得生物信息，但是rRNA這個在RNA中最豐富的成員卻只能提供非常少的轉(zhuǎn)錄本的信息，且檢測到過多的rRNA會掩蓋其它基因的表達(dá)豐富度；因此，通常在測序之前從RNA樣品中除去rRNA，rRNA去除的效率也被視為最大化讀取到轉(zhuǎn)錄物的關(guān)鍵因素。

圖2：人類組織或細(xì)胞總RNA中各種RNA分布餅狀圖
rRNA的“去除法”
目前rRNA去除的方法主要有兩種，一種是通過DNA探針或者RNA探針雜交捕獲rRNA再用磁珠吸附去除的方法，這種方法稱為Ribo-Zero-seq；另一種是利用雙鏈特異性核酸酶處理的方法提取mRNA，稱為DSN-seq。兩種方法對應(yīng)的原理與區(qū)分如下所示：
方法一（DSN-seq）
去除流程：特異性探針（區(qū)分物種）與rRNAs雜交——RNase H消化rRNAs——DNase I消化探針——其他RNA富集純化
市場占比：在市場現(xiàn)有品牌中占據(jù)絕大多數(shù)
優(yōu)勢：樣本起始量要求低；rRNA殘留量更低
缺點：其操作較復(fù)雜；暫無混合樣本效果驗證；
流程圖：
方法二（Ribo-Zero-seq）
去除流程：生物素標(biāo)記探針與rRNAs雜交——鏈霉親和素磁珠去除探針與rRNAs——其他RNA富集純化
市場占比：Illumina RiboZero與Thermo RiboMinus系列使用該方法
優(yōu)勢：磁珠法，操作簡單；可應(yīng)用于混合樣本；
缺點：樣本起始量要求高（一般為1 μg）；rRNA殘留量相對方法1略高；
流程圖：



rRNA的“高效去除”
Hieff NGS^? MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)利用RNase H消化法去除人、小鼠、大鼠總RNA中的核糖體RNA。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果?？捎糜诟咄繙y序分析mRNA和非編碼RNA，也可用于cDNA合成或其它下游應(yīng)用。

圖3：1μg 293T 總RNA 進(jìn)行 rRNA 去除，利用 qPCR 對比去除前后 rRNA 基因和 mRNA 基因的Ct值變化（左圖）
分別以1μg 人、小鼠、大鼠總RNA為樣本，試劑盒去除rRNA后建庫，測序獲得rRNA殘留%數(shù)據(jù)（右圖）