Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒中文操作說明

該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內(nèi)毒素的高品質(zhì)質(zhì)粒，一般來說可從200ml過夜培養(yǎng)的菌液中提取高拷貝質(zhì)粒600-1200ug，低拷貝質(zhì)粒50-400ug。試劑盒自帶的說明書為英文說明書，不是非常方便閱讀，所以本文根據(jù)英文原版重新翻譯了一遍，希望對大家有幫助。

實驗前準(zhǔn)備
1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。

試劑盒型號	加入的乙醇量（ml）
D6926-00B	60
D6926-01B	160
D6926-03B	200
D6926-04B	200每瓶

細(xì)菌的培養(yǎng)：
1. 在容積為1-4升的培養(yǎng)瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養(yǎng)基，加入含目的質(zhì)粒的克隆菌（一般為1/1000比例接種，也即200ul），然后置37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時。為了獲得最佳的效果，推薦接菌使用經(jīng)過夜培養(yǎng)活化的菌種。對于大多數(shù)質(zhì)粒的提取，我們強(qiáng)烈推薦使用endA陰性的菌種，比如DH5α和JM109。
最佳的培養(yǎng)條件對于質(zhì)粒DNA的得率至關(guān)重要。最佳的培養(yǎng)條件包括，首先由新轉(zhuǎn)化或新劃線的培養(yǎng)板中挑取單個克隆，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養(yǎng)基中，37℃振蕩（搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定在約300rpm為宜）培養(yǎng)約8小時；然后繼續(xù)接種于含抗生素的預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩（~300rpm）培養(yǎng)12-16小時。盛培養(yǎng)基的容器的容積需至少為培養(yǎng)基體積的3-4倍（注：保證培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的氧氣，防止厭氧菌的繁殖），初始培養(yǎng)基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜。

為了獲得最佳的效果，我們推薦每次培養(yǎng)后測定OD600值。對于過夜培養(yǎng)活化的細(xì)菌而言，OD600的值處于1.5-2.0之間是細(xì)菌生長良好的指標(biāo)。在測定OD600時，為了保證測量值處于光度計測量的線性范圍（0.1-0.5），需將培養(yǎng)物進(jìn)行必要的稀釋（10到20倍）。當(dāng)接種進(jìn)行大量培養(yǎng)時，我們推薦細(xì)菌的終密度在2.0-3.0之間為宜。當(dāng)使用富營養(yǎng)的培養(yǎng)基，需要注意保證細(xì)菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌，需要首先進(jìn)行劃線并挑取單克隆，然后和前面一樣進(jìn)行必要的活化。

富營養(yǎng)培養(yǎng)基如2xYT或TB，不推薦使用本試劑盒。

堿性-SDS溶液裂解細(xì)菌：
2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
3. 小心去除上清液，為了保證所有上清去除完全，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體，重懸完全對于獲得最高的得率至關(guān)重要;
4. 加10ml SolutionⅡ，來回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液。如有必要可室溫孵育2min。
避免混合時動作過于劇烈，過于劇烈會剪切細(xì)菌的染色體DNA（從而在接下來的步驟中不能被充分沉淀）并且導(dǎo)致質(zhì)粒的純度降低。（當(dāng)Solution II在不使用時，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應(yīng)生成碳酸鹽）
5. 加5ml Buffer N3，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現(xiàn)。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合，以使其充分反應(yīng)。
注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯，呈褐色并且成團(tuán)狀，則需要進(jìn)一步混合以充分中和該溶液，充分中和對于獲得更好的得率至關(guān)重要。使用冰預(yù)冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細(xì)菌蛋白。
6. 準(zhǔn)備結(jié)合柱：加5ml的Buffer GPS至結(jié)合柱中，室溫放置3—10min，3,000—5,000×g室溫離心5min，棄濾液（注：這里中文說明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液”，而在英文原版中是沒有的），把柱子插回50ml收集管中。（注：這里可以使用一個舊的50ml離心管收集廢液，而將試劑盒中附帶的新離心管用于最后一步質(zhì)粒洗脫時使用）。

使用針筒式過濾器過濾裂解物：
7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉(zhuǎn)移至針筒式過濾器中，準(zhǔn)備一個干凈的50ml離心管收集濾液。將過濾器的活塞插回針筒。
8. 將針筒對準(zhǔn)50ml收集管，輕輕推動活塞，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物，不要強(qiáng)行將這些殘留的裂解液推擠過柱。
9. 加入等體積的ETR Binding Buffer（~25ml）到結(jié)合柱上，上下反復(fù)顛倒7-10次。

使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA（注：離心法，適用于同時抽提多個樣品，對于樣本量較少時，推薦使用后面的真空抽濾法）
10. 小心轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子，棄濾液。
11. 重復(fù)步驟10，直至所有裂解液都過濾完，棄濾液。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液。
13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer（預(yù)先添加了乙醇）到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋。如果試劑是低溫保存的，使用前需要預(yù)先恢復(fù)溫度至室溫。
15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結(jié)合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
16. 把空柱子套回離心管，最大轉(zhuǎn)速（不超過6,000×g）離心10—15min使柱子充分干燥。不要跳過該步驟-該步對于去除柱子中殘留的乙醇非常關(guān)鍵。

使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA（注：真空抽濾法，對于樣品個數(shù)較少時，該方法比較節(jié)省時間）
10. 安裝好抽濾裝置，將結(jié)合柱與抽濾瓶密閉結(jié)合
11. 轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，使液體全部濾過柱子。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，洗滌一次（注：流速可能會比較慢）。
13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，洗滌一次。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer（預(yù)先添加了乙醇）到結(jié)合柱上，洗滌一次。
15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次。
16. 繼續(xù)抽真空10-15min，以充分干燥結(jié)合柱（注：當(dāng)抽提多個樣品時，可以選擇離心法步驟16中的方法以節(jié)約時間）。

由結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA（常規(guī)方法，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法）
17. 進(jìn)一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進(jìn)一步干燥結(jié)合柱
    A. 將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
    B. 將結(jié)合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
18. 把結(jié)合柱套在一個新的50ml離心管中（注：可以使用試劑盒附帶的離心管），加入1—3ml（遠(yuǎn)慕注：依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度，可以分步兩次洗脫，第一次少量洗脫保證得到高濃度的質(zhì)粒，第二次稍加大洗脫體積，保證盡可能將質(zhì)粒洗脫完全） Endotoxin-Free Elution Buffer（或去離子水）至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2—5min，以最高轉(zhuǎn)速離心（不超過6,000xg）5min洗脫質(zhì)粒DNA。

上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結(jié)合的DNA。也可以選擇進(jìn)行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收，但二次洗脫的DNA濃度會低一些。另外，第二次洗脫也可以使用首次洗脫下來的液體以保證得到較高濃度的質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升最終的得率。

注意：使用該方法得到的質(zhì)?？梢院芎玫膽?yīng)用與PCR，限制性酶切，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等。預(yù)期的質(zhì)粒濃度可能依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同存在一些出入。但是，一般來說高拷貝的質(zhì)粒終濃度在150-600ug/ml。該方法得到的質(zhì)?？赡軙恍┮掖?xì)埩簦话悴粫绊懴掠螌嶒?。如果需要獲得更高的質(zhì)粒濃度和完全去除乙醇?xì)埩簦梢赃x擇使用下面的方法。


另一種結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA的方法

1. 把結(jié)合柱套在一個新的50ml離心管中（注：可以使用試劑盒附帶的離心管），加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer（或去離子水）至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2min，以最高轉(zhuǎn)速離心（不超過6,000xg）5min以洗脫質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升最終的得率。

2. 將洗脫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到一個干凈的適用于沉淀的離心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻，然后以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心30min。小心地去除上清。

3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次，以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心10min，小心地去除上清?？諝飧稍锍恋?-10min。

4. 加入200-500ul（依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度）Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA。