免疫球蛋白IgG的提取

2016-11-29 16:04 來(lái)源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

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一、目的及要求
了解和掌握免疫球蛋白的提取方法。

二、概念
抗體是在抗原物質(zhì)刺激下，人或脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的漿細(xì)胞產(chǎn)生的，能與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的免疫球蛋白，主要存在于人和動(dòng)物的血清及其體液中。

三、免疫血清的制備
（一）動(dòng)物的選擇
實(shí)驗(yàn)室常用的動(dòng)物是家兔和羊，有時(shí)也用豚鼠或雞，大量制備商品性抗血清時(shí)，可采用馬、牛等大動(dòng)物。對(duì)動(dòng)物的基本要求是：
1、與抗原物質(zhì)的種屬關(guān)系越遠(yuǎn)越好；
2、發(fā)育成熟、健壯、體重合乎規(guī)定，如家兔要求體重在2～3Kg以上；
3、最好為成年雄性動(dòng)物，如用雌性動(dòng)物，則不得用懷孕者。

（二）抗原的種類、質(zhì)量要求及用量
1、抗原的種類
抗原是決定所制備免疫血清特異性的關(guān)鍵，在免疫前必須進(jìn)行鑒定。
制備免疫血清的抗原可以分為以下三類：
1）微生物抗原：如細(xì)菌、病毒、立克次氏體、螺旋體、真菌等；
2）組織抗原：主要是各種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，如各種酶類、激素、結(jié)締組織成分、血漿蛋白、腫瘤組織等；
3）免疫球蛋白抗原：這種抗原在免疫熒光和免疫酶技術(shù)中應(yīng)用最廣；
2、抗原的純度
抗原純度要高，應(yīng)用病原微生物時(shí)，應(yīng)選擇抗原性強(qiáng)、穩(wěn)定和標(biāo)準(zhǔn)的菌株或毒株。細(xì)菌性抗原應(yīng)避免有培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)病毒的組織盡量采用與被免疫動(dòng)物同種的組織，培養(yǎng)用的生長(zhǎng)液也應(yīng)避免含有抗原性強(qiáng)的物質(zhì)，用Hank ′s氏液等為好。
3、抗原的用量
抗原量過(guò)小，不能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；抗原量過(guò)大，也影響抗體的產(chǎn)生，所以抗原量要適當(dāng)。抗原用量視抗原種類、劑型和注射途徑而異。采用弗氏佐劑，劑量較小，一次注射劑量以1mg/kg體重為宜，不加佐劑的劑量要大10倍以上。靜脈注射劑量要小些，以免引起動(dòng)物死亡。

（三）免疫的途徑與方法
免疫途徑應(yīng)是多種多樣的，如靜脈、腹腔、肌肉、皮內(nèi)、皮下和淋巴結(jié)等，但肌肉和皮內(nèi)兩種途徑較少應(yīng)用。目前一般傾向于小劑量、多點(diǎn)、多途徑的方法，但具體應(yīng)視抗原的生物學(xué)特性和理化特性來(lái)決定。酶、毒素等生物活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。球蛋白抗原免疫可選用皮下、皮內(nèi)和肌肉注射。但效價(jià)不高，因此大都選用抗原加弗氏佐劑、足掌皮下注射的方法，或者注卡介苗使腘淋巴結(jié)腫脹，然后直接注入腘淋巴結(jié)內(nèi)的方法，增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生。
足掌注射為近年來(lái)常用的免疫途徑，能獲得相當(dāng)良好的效果，但劑量不宜過(guò)大，一般家兔0.2～0.5mL，否則腫脹嚴(yán)重。有的采用先經(jīng)足掌內(nèi)注射卡介苗（后足掌各注 0.2～0.5mL）。10～14d后，腘淋巴結(jié)腫大，然后向淋巴結(jié)內(nèi)注射加有完全佐劑的抗原，兩側(cè)各0.5mL左右，半個(gè)月后再注射不加佐劑的抗原（3mg/mL）皮下或肌肉多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.1mL，總量0.5mL左右、這樣免疫效果較為理想。
注射次數(shù)可分為一次注射和多次注射兩種。一次注射，抗體產(chǎn)生的慢，效價(jià)低，但特異性高，如果再次注射，抗體產(chǎn)生的快，效價(jià)高，持續(xù)時(shí)間也較久。多次注射，可得高效價(jià)血清，但往往特異性較差．多次免疫的間隔時(shí)間，可因抗原性質(zhì)不同而異。

（四）佐劑
佐劑是一種和抗原一起免疫動(dòng)物，能增強(qiáng)抗原的免疫原性，加強(qiáng)抗體形成的物質(zhì)，如明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、結(jié)核分枝桿菌、短小棒狀桿菌和細(xì)菌內(nèi)毒素等。
細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原的免疫原性較好，通常均用其懸液直接免疫，不加佐劑。可溶性抗原，尤其純化制劑，一般免疫原性較低，應(yīng)該加入一定的佐劑，以提高其免疫效能。
目前常用弗氏佐劑（Freundt′sadiuvant），其主要成分為羊毛脂、石蠟油和卡介苗所組成。有卡介苗為弗氏完全佐劑，不加卡介苗為弗氏不完全佐劑。弗氏佐劑配方有多種，羊毛脂與石蠟油之比，一般為1︰2（羊毛脂10g加液體石蠟油20mL），也有用1︰3、1︰4甚至1︰9 的，應(yīng)根據(jù)藥品質(zhì)量而定。先將羊毛脂與石蠟油按比例混合好，羊毛脂1份、液體石蠟油2～4份，混勻，高壓滅菌，冰箱保存，臨用前與等量抗原溶液混和研磨，乳化，即為弗氏不完全佐劑抗原。如在其中加入2～4mg/mL卡介苗（100℃、10min殺菌），則稱為弗氏完全佐劑抗原。充分乳化是獲得良好免疫效果的關(guān)鍵，如果放置后油水分層，表明乳化不良，滴于水上不擴(kuò)散為乳化良好．有時(shí)可加入1%Tween-80，以加強(qiáng)乳化效果。

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