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高通量測(cè)序（NGS）的原理

2016-09-30 1:11 來(lái)源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

高通量測(cè)序（NGS）的原理

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高通量測(cè)序（High-Throughput Sequencing）又名下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對(duì)于傳統(tǒng)的桑格測(cè)序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量測(cè)序的主要平臺(tái)代表有羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測(cè)序儀（ABI SOLiD sequencer）。

Solexa的測(cè)序原理是可逆終止化學(xué)反應(yīng)。DNA片段加上接頭之后，可以隨機(jī)的附著于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面經(jīng)過(guò)橋式擴(kuò)增。這樣就形成了數(shù)千份相同的單分子簇，被用做測(cè)序模板。測(cè)序采取邊合成邊測(cè)序的方法，和模板配對(duì)的ddNTP原料被添加上去，不配對(duì)的ddNTP原料被洗去，成像系統(tǒng)能夠捕捉熒光標(biāo)記的核苷酸。隨著DNA 3'端的阻斷劑的去除，下一輪的延伸就可以進(jìn)行。和焦磷酸測(cè)序不同，每次DNA的只能延伸一個(gè)核苷酸。Solexa的讀長(zhǎng)在100-150bp之間，適合小RNA鑒定、甲基化和表觀遺傳學(xué)研究。

ABI Solid技術(shù)的核心是4種熒光標(biāo)記寡核苷酸的連接反應(yīng)測(cè)序。測(cè)序之前，DNA模板通過(guò)乳化PCR擴(kuò)增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修飾的微珠可以沉淀在玻片上。連接測(cè)序所用的底物是8個(gè)堿基熒光探針混合物，根據(jù)序列的位置，樣品DNA就可以被探針標(biāo)記。DNA連接酶優(yōu)先連接和模板配對(duì)的探針，并引發(fā)該位點(diǎn)的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。Solid的讀長(zhǎng)只有50-75bp，精確度可達(dá)Q40，適于基因組重測(cè)序和SNP檢測(cè)。

三個(gè)廠家的高通量測(cè)序儀器雖然各具特點(diǎn)，在原理上很多的共同之處：

1 將目標(biāo)DNA剪切為小片段

2 單個(gè)小片段DNA分子結(jié)合到固相表面

3 單分子獨(dú)立擴(kuò)增

4 每次只復(fù)制一個(gè)堿基（A,C,T,G）并檢測(cè)信號(hào)

5 高分辨率的成像系統(tǒng)

高通量測(cè)序以其高輸出量與高解析度的特性，不僅為我們提供了豐富的遺傳學(xué)信息，而且使得測(cè)序的費(fèi)用和時(shí)間大大縮短。在高通量測(cè)序發(fā)展的過(guò)程中，也有很多的問(wèn)題需要我們?nèi)ソ鉀Q：數(shù)據(jù)在臨床診斷上的作用，測(cè)序數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和分析，數(shù)據(jù)的安全和信息隱私等。

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