細(xì)胞株培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題解決

  細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。然而，細(xì)胞株在體外培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，比如：細(xì)胞株無(wú)法在培養(yǎng)皿上貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞株生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞株死亡等。那么該如何解決呢？ 一、細(xì)胞株無(wú)法在培養(yǎng)器皿上貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞株胰酶消化過(guò)度：縮短胰酶消化時(shí)間或減少胰酶用量。

2.支原體污染：隔離細(xì)胞株，檢測(cè)是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞株被污染，滅菌處理后丟棄。

3.培養(yǎng)基中無(wú)附著因子：如果使用的是無(wú)血清配方，應(yīng)確保含有附著因子或者使用經(jīng)過(guò)包被的培養(yǎng)板。

二、細(xì)胞株生長(zhǎng)緩慢

培養(yǎng)基或血清改變：比較不同培養(yǎng)基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有無(wú)差異；通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)比較新老批次血清有無(wú)差異；增大細(xì)胞株初始接種密度；使細(xì)胞株逐步適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

2.必需生長(zhǎng)促進(jìn)成分（如L-谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子）耗竭、缺乏或分解：去除原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)促進(jìn)成分（如L-谷氨酰胺）。

3.輕度細(xì)菌或真菌污染：在不添加抗生素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄。

4.時(shí)間存儲(chǔ)不當(dāng)：血清應(yīng)于-5℃至-20℃下儲(chǔ)存；培養(yǎng)基應(yīng)于2℃~8℃下避光儲(chǔ)存；盡量減少血清和培養(yǎng)基見(jiàn)光時(shí)間。

5.細(xì)胞株初始接種密度低：增大活細(xì)胞接種密度。

6.細(xì)胞株衰老、老化：將老化細(xì)胞丟棄，取用代數(shù)較少的細(xì)胞。

7.支原體污染：隔離細(xì)胞株，檢測(cè)是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄。

三、培養(yǎng)基pH值變化迅速

1.培養(yǎng)箱CO2分壓設(shè)置錯(cuò)誤：根據(jù)培養(yǎng)基中NaHCO3的濃度增大或降低培養(yǎng)箱CO2的分壓，NaHCO3濃度為2.0-3.7g/L時(shí)，應(yīng)相應(yīng)地使用5%-10%的CO2分壓。

2.細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋過(guò)緊：將瓶蓋旋松1/4圈。

3.碳酸氫鹽緩存系統(tǒng)緩沖能力不足：加入HEPES緩沖液，使其終濃度為10-25mM。

4.培養(yǎng)基中鹽含量不正確：CO2平衡環(huán)境中使用以Earle平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，大氣條件下使用以Hanks平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基。

以上就是細(xì)胞株在培養(yǎng)過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題、原因以及解決方法，希望可以幫助大家在培養(yǎng)細(xì)胞株過(guò)程中遇到的困難，僅供參考。

5.細(xì)菌、酵母或真菌污染：將細(xì)胞和培養(yǎng)基滅菌處理后丟棄。

四、細(xì)胞株凋亡

培養(yǎng)箱中無(wú)CO2：監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱中CO2使用速度以便確定及時(shí)更換氣瓶；經(jīng)常檢測(cè)管路連接處是否漏氣；不要頻繁開(kāi)啟培養(yǎng)箱門(mén)。

2.培養(yǎng)箱內(nèi)溫度有波動(dòng)：監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，及時(shí)校正。

3.使用抗生素達(dá)到毒性濃度：減少抗生素的用量；使用無(wú)血清培養(yǎng)基時(shí)，抗生素濃度應(yīng)降低至1/10。

4.細(xì)胞株復(fù)蘇或凍存時(shí)受到損傷：取用新的細(xì)胞。

5.培養(yǎng)基的滲透壓不合適：檢查完全培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可耐受260~350mOsm/kg的滲透壓，加入某些試劑和藥物后會(huì)影響培養(yǎng)基的滲透壓；昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓（340~380mOsm/kg）要高于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

6.培養(yǎng)基中毒性代謝產(chǎn)物蓄積：去除原培養(yǎng)基，換用新鮮培養(yǎng)基。

五、懸浮細(xì)胞株集成團(tuán)

存在鈣離子和鎂離子：用不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。

2.支原體污染：隔離細(xì)胞，檢測(cè)是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄。

3.蛋白水解酶消化過(guò)度導(dǎo)致細(xì)胞裂解、DNA釋放：用0.001%DNA酶I處理細(xì)胞；用PBS沖洗后再接種到新培養(yǎng)基中。