流式細(xì)胞術(shù)(FCM)實(shí)驗(yàn)原理與應(yīng)用詳解

流式細(xì)胞術(shù)：即FCM。很多小伙伴在做實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)碰到很多問題，比如：無信號(hào)、熒光強(qiáng)度高等一系列問題，接下來就來聊聊流式細(xì)胞技術(shù)！

目前，流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)特征的分析，界定不同種類的細(xì)胞群，測(cè)定分離出的亞類純度，分析細(xì)胞的大小和總量，它可以同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)。它主要用于檢測(cè)標(biāo)記在抗體上的熒光強(qiáng)度，這些熒光抗體則可以檢測(cè)與特定細(xì)胞分子結(jié)合的蛋白或配體，如與 DNA 結(jié)合的溴化丙啶 (PI) 等。
實(shí)驗(yàn)原理

待測(cè)樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進(jìn)樣管而進(jìn)入流動(dòng)室，排成單列的細(xì)胞，由流動(dòng)室的噴嘴噴出而成為細(xì)胞液流，并與入射激光束相交。細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細(xì)胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長(zhǎng)。熒光檢測(cè)器為光電倍增管。散射光檢測(cè)器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細(xì)胞大小有關(guān)。

臨床應(yīng)用

1、 細(xì)胞生物學(xué)研究

流式細(xì)胞術(shù)可用于測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分比。通過測(cè)定細(xì)胞群體中每個(gè)細(xì)胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲線。同時(shí)可進(jìn)行多參數(shù)分析，即同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種性質(zhì)。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。此外,流式細(xì)胞術(shù)還可測(cè)定細(xì)胞群體同步化的程度和所處的時(shí)期，鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，利用熒光標(biāo)記配體，還可定量測(cè)定細(xì)胞表面和內(nèi)部的受體等。是研究DNA合成和細(xì)胞周期的一種非常有用的技術(shù)。

2、細(xì)胞免疫學(xué)

結(jié)合免疫熒光方法，流式細(xì)胞術(shù)可辨認(rèn)和計(jì)數(shù)帶有不同表面特異性抗原的細(xì)胞，此外，流式細(xì)胞術(shù)還可用于定量分析結(jié)合于細(xì)胞上的熒光素標(biāo)記的外源凝集素，測(cè)定細(xì)胞表面積和熒光素結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)密度，結(jié)合細(xì)胞動(dòng)力學(xué)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，以及研究各種外源凝集素與細(xì)胞表面結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性等。

3、腫瘤學(xué)

應(yīng)用主要是通過測(cè)DNA含量實(shí)現(xiàn)的，包括癌前病變檢查、早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評(píng)估等。

正常細(xì)胞均是DNA二倍體，當(dāng)細(xì)胞癌基因表達(dá)或者由良性的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞中DNA水平會(huì)發(fā)生改變，這些細(xì)胞的DNA倍體變化或者染色體結(jié)構(gòu)異常在FCM檢測(cè)過程中會(huì)以DNA倍體數(shù)量的改變表現(xiàn)出來。FCM對(duì)DNA異倍體精確的分析是腫瘤診斷、間葉組織良惡性腫瘤判斷的重要依據(jù)。利用FCM還可以測(cè)定腫瘤細(xì)胞的增殖活性、分化程度和凋亡水平，這些細(xì)胞參數(shù)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，并為腫瘤臨床治療方案的選擇提供可靠的理論基礎(chǔ)。

4、遺傳學(xué)

用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個(gè)峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。

常見問題及解答

問題：無信號(hào)/熒光強(qiáng)度弱

問題分析：

1、 不正確的信號(hào)補(bǔ)償

2、 沒有足夠的抗體來檢測(cè):增加抗體的量/濃度；

3、 無法接近細(xì)胞內(nèi)目標(biāo):檢查目標(biāo)蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)。

4、 細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)合熒光分子太大

5、 激光器未對(duì)齊

6、 目標(biāo)蛋白不存在或處于低水平表達(dá)

7、 可溶性或分泌型目標(biāo)蛋白

8、 一抗和二抗不匹配

9、 熒光分子的熒光逐漸消退

解決方法

1、 確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲(chǔ)。

2、確保商品化抗體沒有超過有效期。

3、 確保已正確加入足量的抗體。

4、確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗。

5、使用了正確的二抗，就是說二抗能夠識(shí)別你的一抗。

6、檢測(cè)的是PE或APC熒光素的抗體，確保該抗體未被冰凍過。

7、檢測(cè)的組織上是否表達(dá)該抗原？可查看相關(guān)文獻(xiàn)了解該抗原的表達(dá)情況，或者同時(shí)做一個(gè)陽性對(duì)照。

問題：熒光強(qiáng)度過高

問題分析：

1、 抗體濃度過高

2、 過量抗體被困

3、 封閉不足

解決方法：

1、 減少每個(gè)樣本中加入的抗體量；

2、 確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或 Triton；

3、 與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3% 封閉試劑；

問題：觀察到兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群但應(yīng)該只有一群細(xì)胞

問題分析：

1、 不止一類細(xì)胞表達(dá)目的蛋白

2、 出現(xiàn)細(xì)胞雙峰

3、 側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）

4、 細(xì)胞裂解

5、 細(xì)菌污染

解決方法：

1、 確保細(xì)胞充分分離；

2、 染色前輕輕地混合細(xì)胞，在放入流式細(xì)胞儀前用吸管再次混勻，也可以篩選或過濾細(xì)胞以除去團(tuán)塊

3、 樣品應(yīng)是新鮮的并且是正確制備的。細(xì)胞不能高轉(zhuǎn)速離心或劇烈震蕩；

問題：結(jié)果與預(yù)期相反

問題分析：

1、 有些試劑可能會(huì)影響某些抗原檢測(cè)，例如EDTA可影響一些血小板標(biāo)記的檢測(cè)。

2、 裂解液也可以影響一些抗原檢測(cè)

3、 有些抗原是表達(dá)在胞內(nèi)的

解決方法：

1、 可采用PBMC提取法

2、 需選擇正確的破膜劑進(jìn)行正確的破膜處理。