植物提取物常用檢測方法介紹

含量測定的定量分析法大類上主要包括：色譜分析法,光譜分析法，定量分析法。

一、色譜分析法

色譜分析法是一種分離分析方法，系根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，將組分從混合物中分離后再選擇性對待測組分進行分析的方法。因此色譜分析法是分析混合物的最有力的手段。

1. 高效液相色譜法（HPLC）

 HPLC全稱是High Performance Liquid Chromatography（高效液相色譜法），又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來分析測定。HPLC檢測方法，因對含有眾多成分的復雜體系具有強大的分離功能，且分析速度快，其重現(xiàn)性和準確度優(yōu)于薄層色譜法。是中藥及其制劑含量測定的首選方法，中國藥典大多采用 HPLC 進行含量測定。

 1.1 高效液相色譜分析的流程

由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

    1.2 高效液相色譜的分離過程

同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。

開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C 在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。

不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。

1.3 高效液相色譜含量計算

一般分面積歸一法，外標法，內(nèi)標法，植物提取物用前兩個比較多。

面積歸一化法：假定樣品中的所有組分全部流出而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號，計算各雜質峰面積以及總和。該方法操作簡單，不用標準品，結果相對準確，但是校正因子確定繁瑣和重復性不好。國內(nèi)植物提取物廠家很多為用的是這種檢測方法。

外標法：要用標準品，檢測結果準確，但是受標準物質和線性范圍影響。標準品分國產(chǎn)和進口的，有時客戶會指定進口的標品，價格比較昂貴。

內(nèi)標法： 色譜分析中一種比較準確的定量方法，尤其在沒有標準物對照時，此方法更顯其優(yōu)越性。內(nèi)標法是將一定重量的純物質作為內(nèi)標物(參見內(nèi)標物條)加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內(nèi)標物的樣品進行色譜分析，分別測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積(或峰高)及相對校正因子，按公式和方法即可求出被測組分在樣品中的百分含量。檢測結果很準確但是內(nèi)標物選擇困難。植物提取物一般不用。

2. 薄層色譜分析法（TLC）

薄層色譜分析法是將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開后，根據(jù)比移值(Rf)與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值(Rf)作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質檢查或含量測定的方法。

薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固－液吸附色譜。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時，把吸附層加厚，將樣品點成一條線，則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外，在進行化學反應時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應是否完成。

3. 氣相色譜法（GC）

GC：Gas Chromatography 氣相色譜法用氣體作為移動相的色譜法。用氣體為流動相流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法，一般用于測揮發(fā)物質的含量，比如農(nóng)藥殘留 666，DDT 的檢測用的就是這種方法。

根據(jù)所用固定相的不同可分為兩類：固定相是固體的，稱為氣固色譜法；固定相是液體的則稱為氣液色譜法。

氣相色譜系統(tǒng)由盛在管柱內(nèi)的吸附劑，或惰性固體上涂著液體的固定相和不斷通過管柱的氣體的流動相組成。將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入后，由于固定相對樣品中各組分吸附或溶解能力不同，即各組分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)有差別，當組分在兩相中反復多次進行分配并隨移動相向前移動時，各組分沿管柱運動的速度就不同，分配系數(shù)小的組分被固定相滯留的時間短，能較快地從色譜柱末端流出。以各組分從柱末端流出的濃度 c對進樣后的時間t作圖，得到的圖稱為色譜圖。

二、光譜分析法

當物質吸收輻射能或者熱能后，其內(nèi)部發(fā)生能級躍遷，記錄由能級躍遷所產(chǎn)生的輻射能隨波長的變化所得到的圖譜成為光譜。利用物質光譜進行定性，定量和結構分析的方法稱為光譜分析法。

1. 紫外吸收光譜分析法（UV）

UV檢測法也是植物提取物常用的檢測方法之一，UV全稱紫外-可見分光光度法，是 Ultraviolet and visiblespectrophotometry 的縮寫，是基于物質分子對紫外光區(qū)(波長200~400nm)和可見光區(qū)(波長為 400~760nm)的單色光輻射的吸收特性建立的色譜分析方法。UV檢測也稱紫外檢測法、紫外光譜檢測法。 UV檢測法主要用于配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測定。紫外光譜是分子中某些價電子吸收了一定波長的電磁波,由低能級躍近到高能級而產(chǎn)生的一種光譜，當分子中的電子吸收能量后會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后放出能量（輻射出特征譜線），回到基態(tài)；而輻射出特征普線的波長在紫外區(qū)中就叫做紫外光譜（UV）。

1.1 UV定性分析

在有機化合物的定性分析中，紫外－可見光譜適用于不飽和有機化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結構。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質譜法進行定性鑒定和結構分析，因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。一般有兩種定性分析方法，比較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗規(guī)則計算最大吸收波長λmax，然后與實測值進行比較。 結構分析可用來確定化合物的構型和構象。如辨別順反異構體和互變異構體。

1.2 UV定量分析

紫外－可見分光光度定量分析的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即在一定波長處被測定物質的吸光度與它的溶度呈線性關系。應此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度可求出該物質在溶液中的濃度和含量。常用的測定方法有：單組分定量法、多組分定量法、雙波長法、示差分光光度法和導數(shù)光譜法等。

1. 原子吸收光譜法（AAS）

原子吸收光譜法（AAS），全稱是Atomic Absorption Spectrometry。是基于氣態(tài)的基態(tài)原子外層電子對紫外光和可見光范圍的相對應原子共振輻射線的吸收強度來定量被測元素含量為基礎的分析方法，是一種測量特定氣態(tài)原子對光輻射的吸收的方法。

AAS基本原理是，每一種元素的原子不僅可以發(fā)射一系列特征譜線，也可以吸收與發(fā)射線波長相同的特征譜線。當光源發(fā)射的某一特征波長的光通過原子蒸氣時，即入射輻射的頻率等于原子中的電子由基態(tài)躍遷到較高能態(tài)（一般情況下都是第一激發(fā)態(tài)）所需要的能量頻率時，原子中的外層電子將選擇性地吸收其同種元素所發(fā)射的特征譜線，使入射光減弱。

由于原子能級是量子化的，因此，在所有的情況下，原子對輻射的吸收都是有選擇性的。由于各元素的原子結構和外層電子的排布不同，元素從基態(tài)躍遷至第一激發(fā)態(tài)時吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收線具有不同的特征。原子吸收光譜位于光譜的紫外區(qū)和可見區(qū)。

三、定量分析法

定量分析法也稱滴定法，是將已知濃度的滴定液(標準物質溶液)由滴定管滴加到被測溶液中，直至滴定液與被測物質反應完全(通過適當方法指示)，然后根據(jù)滴定液的濃度和被消耗的體積，按化學計量關系計算出被測物質的含量。

四：目前植物提取物常見五種檢測方法的應用領域
 

檢測方法	應用領域
高效液相色譜法（HPLC）	標準植物提取物的常用檢測方法
薄層色譜分析法（TLC）	被用于比例提取物的檢測
氣相色譜法（GC）	用來檢測揮發(fā)性液體或油類
紫外分光光度計（UV）	標準植物提取物的常用檢測方法
原子吸收光譜法（AAS）	用于提取物重金屬含量的檢測