細(xì)胞融合的方法與注意事項(xiàng)

一、細(xì)胞融合的方法有三種：生物方法、化學(xué)方法、物理方法。

二、細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交,是指細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng),在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通過無性方式融合(合并)成一個(gè)核或多核的雜合細(xì)胞的過程。體細(xì)胞融合后可形成四倍體或多倍體細(xì)胞，由此形成的雜交細(xì)胞，其特性會(huì)有很大的變化。
三、化學(xué)誘導(dǎo)融合
1.鹽類融合法。此法是應(yīng)用最早的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法。鹽類融合劑對原生質(zhì)體的破壞小。今后研究應(yīng)提高其融合率,使其對液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體能夠誘發(fā)融合。

2.高鈣和高pH值融合法。高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)融合。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。

3、聚乙二醇融合法(PEG法)。1974年發(fā)現(xiàn)的聚乙二醇(PEG)使不同科屬的植物原生質(zhì)體之間都可以融合，融合率可達(dá)30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，從而引起細(xì)胞融合。為了發(fā)揮PEG促進(jìn)細(xì)胞融合的效力，必須采用較高的濃度(40%～50%，分子量為6000)，但PEG在高濃度下，細(xì)胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時(shí)間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。影響原生質(zhì)體融合的因素很多。特別是環(huán)境中的陽離子存在，融合時(shí)的pH?也對原生質(zhì)體融合有較明顯的影響。一般來講鈣、鎂離子有助于融合。如有鈣離子存在時(shí)，可得到較高的融合率。但在缺乏鈣離子時(shí)，若pH?較低，融合頻率也較高。這是因?yàn)殁}離子和帶負(fù)電荷的PEG與細(xì)胞膜表面分子相互作用，使原生質(zhì)體帶電，彼此易于附著發(fā)生凝集所致。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便等特點(diǎn)，在細(xì)胞融合領(lǐng)域取得了可喜的成績，大量的研究仍采用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報(bào)道，但存在著對細(xì)胞損傷大、殘存有毒性、融合率較底及經(jīng)驗(yàn)性大等缺陷。

四、物理誘導(dǎo)融合
1.細(xì)胞電融合技術(shù)細(xì)胞電融合是以脂質(zhì)膜和脂質(zhì)一蛋白質(zhì)膜的電學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)的，以雙向電泳和電子擊穿細(xì)胞質(zhì)膜的聯(lián)合作用為手段，和細(xì)胞電注射構(gòu)成一對互補(bǔ)技術(shù)。在短時(shí)間強(qiáng)電場的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性電擊穿(Reverisb?leb?reakdown)，瞬時(shí)失去其高電阻和低通透特性，然后在數(shù)分鐘后恢復(fù)原狀。當(dāng)可逆電擊穿發(fā)生在兩個(gè)相鄰細(xì)胞的接觸區(qū)時(shí)，即可誘導(dǎo)他們的膜相互融合，從而導(dǎo)致細(xì)胞融合。

細(xì)胞融合分為兩步：第一步是建立細(xì)胞間接觸(cell-to-cell?contact)?；?第二步，接受區(qū)膜結(jié)構(gòu)受擾動(dòng)而紊亂，然后恢復(fù)并融合。根據(jù)其誘導(dǎo)細(xì)胞接觸的性質(zhì)，分為特異性和非特異性兩大類。非特異性細(xì)胞電融合法是指在進(jìn)行細(xì)胞電融合時(shí)，無法排除親本細(xì)胞的自體融合而只進(jìn)行雙親本間的細(xì)胞雜交融合。主要原因是細(xì)胞間的相互接觸是無選擇性的，是非特異性細(xì)胞聚集。非特異性電融合技術(shù)包括細(xì)胞物理聚集電融合法和細(xì)胞化學(xué)聚集電融合法。

細(xì)胞融合所必需的兩個(gè)步驟為：
①細(xì)胞間接觸；
②接觸區(qū)的膜結(jié)構(gòu)受到瞬間擾動(dòng)而導(dǎo)致融合。只要其中的任意一步有特異性，就能形成特異性的細(xì)胞融合。?

2.激光誘導(dǎo)法。激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合術(shù)是利用激光微束對相鄰細(xì)胞接觸區(qū)的細(xì)胞膜進(jìn)行破壞(或擾動(dòng))，可將兩個(gè)不同特性、不同大小的細(xì)胞在顯微鏡下實(shí)現(xiàn)融合。即利用光鑷捕捉并拖動(dòng)一個(gè)細(xì)胞使之靠近另一個(gè)細(xì)胞并緊密接觸，然后對接觸處進(jìn)行脈沖激光束處理，使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，產(chǎn)生微米級的微孔。這樣，由于質(zhì)膜上微孔的可逆性，細(xì)胞開始變形融合，最終成為一個(gè)細(xì)胞。使用此技術(shù)時(shí)，使細(xì)胞接觸的方法可用①光俘虜法；②用低濃度的融合劑PEG?(5%?)使細(xì)胞聚法。目前，最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細(xì)胞間接觸，即光鑷?yán)眉す飧咚构馐鈭龅奶荻攘Π鸭?xì)胞從光束邊緣拉向光束中間，在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時(shí)，指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力，該梯度力把細(xì)胞豎直地拉到激光束腰下方處，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的操作。

細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

1、整個(gè)制備過程需嚴(yán)格無菌及溫度控制。

2、細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)注意適時(shí)更換培養(yǎng)液。

3、SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞比例需嚴(yán)格控制，這決定了融合率。

4、融合細(xì)胞因細(xì)胞膜受損而特別脆弱，操作過程需溫和小心。

5、融合劑PEG的加入時(shí)間需準(zhǔn)確把握，避免融合失敗。