質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)操作步驟

該實(shí)驗(yàn)主要有兩個用途：
1．重組質(zhì)粒的鑒定。當(dāng)質(zhì)粒的重組或其它載體重組后，通常會發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗，包括質(zhì)粒的自身環(huán)化。因而要求進(jìn)行篩選，把重組成功的質(zhì)粒找出來。在目前常用的質(zhì)粒和其它載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因，一旦重組成功，質(zhì)粒環(huán)化（包括自身環(huán)化），抗生素抗性基因表達(dá)，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抗相應(yīng)抗生素的能力，可以含該抗生素的培養(yǎng)基中生長傳代，不然，重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。

2.為擴(kuò)增質(zhì)粒和其它載體作準(zhǔn)備。由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20~30分鐘，而且常用質(zhì)粒可以在大腸桿菌中達(dá)到幾百個拷貝，因此，通過對轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短時內(nèi)極大地擴(kuò)增目的質(zhì)粒。（作為分子生物學(xué)用大腸桿菌，是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室改造過的工程菌。）

實(shí)驗(yàn)原理
本實(shí)驗(yàn)通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細(xì)菌。這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒，產(chǎn)生5×106~2×107個轉(zhuǎn)化的菌落。當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后，質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面，在42℃的溫度時，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質(zhì)?？赏ㄟ^大腸桿菌細(xì)胞膜上形成的空隙進(jìn)入菌體內(nèi)。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37℃振動培養(yǎng)可使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
一．器材
天平、秤量匙、秤量皿
加熱磁力攪拌器、攪拌子
可調(diào)移液器P1000、P200、P20及其經(jīng)消毒的盒裝藍(lán)、黃吸頭
經(jīng)消毒的1.5ml Eppendorf管、試管架及其水浴用試管架
定時器、記號筆、一次性手套和筒紙
42℃恒溫水浴
4℃和-70℃冰箱
煤氣燈或酒精燈
恒溫培養(yǎng)搖床（調(diào)至37℃，225rpm）
37℃培養(yǎng)箱
玻璃涂棒（普通玻璃吸管，細(xì)頭部在煤氣燈上燒成“L”形）
消毒過的潔凈培養(yǎng)皿（直徑10cm）

二．試劑
LB培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g
細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g
NaCl 5g

加800ml水，放入磁力攪拌棒，在磁力攪拌器上攪拌至徹底溶解，用5M NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高壓15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分鐘，冷卻后可加入氨芐青霉素（50mg/ml）500ul，視載體特性而定，混勻，即為含抗生素的LB培養(yǎng)液。存放于避光處。

含有瓊脂的培養(yǎng)基
即在以上1000ml培養(yǎng)基中加入15g細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂。

抗生素瓊脂平板
待含有瓊脂的培養(yǎng)基冷卻后，加入抗生素，傾入培養(yǎng)皿，約30~50 ml，用煤氣燈火焰掠過培養(yǎng)基表面，以消除氣泡。冷卻后，標(biāo)記，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

pH試紙（或pH計）

三．實(shí)驗(yàn)材料
來源于實(shí)驗(yàn)一的重組質(zhì)粒
受感態(tài)大腸桿菌
碎冰及碎冰保溫盛器

實(shí)驗(yàn)步驟
自-70℃冰箱中取出受感態(tài)大腸桿菌，插入濕冰中溶解約15分鐘，輕輕混勻。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻將細(xì)菌放回-70℃冰箱。
細(xì)菌50 ul
DNA 5 ul
輕輕混勻，靜置冰上30分鐘。
于42℃水浴中熱休克細(xì)菌45秒，迅速移入濕冰中，靜置2分鐘，加入900ul LB培養(yǎng)液，放入37℃恒溫箱搖床，225rpm搖晃培養(yǎng)1小時。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB瓊脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培養(yǎng)箱中過夜。
次日，檢查各培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)菌落。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
轉(zhuǎn)化成功，培養(yǎng)皿中可見散在的菌落。
轉(zhuǎn)化失敗，培養(yǎng)皿上無菌落，或菌落布滿如苔樣，后者提示可能是抗生素濃度不夠或失效。