熒光定量PCR標準曲線有幾個梯度?

相對定量

相對定量得到的結(jié)果為特定樣本中目的基因相對于另一參照樣本的量的變化。

在某些不需要對基因進行絕對定量，只需要確定基因相對表達差異的情況下，如某樣品在經(jīng)過某種處理后目的基因表達量是增加了還是減少了，用相對定量的方法就可以得到結(jié)果，相對定量是一種更普遍、更簡單的方法。

內(nèi)參基因

實驗操作中，由于選取樣品時，其細胞個數(shù)不可能完全相同、RNA提取的得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調(diào)控研究中需要使用內(nèi)參基因來標準化樣品，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。

相對定量就是通過檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達變化來實現(xiàn)定量的。

內(nèi)參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內(nèi)參照，常用的內(nèi)參基因有GAPDH基因、β-Actin基因、18S rRNA基因等。

內(nèi)參基因需滿足：

在研究樣本之間的表達是相似的；

處理因素不會影響其表達；

與待測基因同時進行相同的PCR擴增。

盡管在大多數(shù)情況下內(nèi)參基因的表達非常穩(wěn)定，但是其表達在某些情況下也會發(fā)生變化，并不是任何內(nèi)參基因都適合任何實驗。在選擇內(nèi)參基因時，應(yīng)仔細考慮各種因素，選擇合適的內(nèi)參基因或內(nèi)參基因組合。

基因表達變化倍數(shù)計算方法

比較Ct法是運用數(shù)學公式來計算基因表達的相對變化量，用該方法進行基因表達定量時，來自于同一樣品的目的基因和內(nèi)參基因都要進行Real-Time qPCR反應(yīng)，定量的結(jié)果由目的基因與內(nèi)參基因Ct之間的差值來反應(yīng)。

該方法除了使用內(nèi)參基因以外，還使用了參照樣品，使得能夠比較機體的不同組織或不同實驗處理組之間的基因表達變化。

使用該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相同且都為1，但是內(nèi)參基因畢竟與目的基因存在較大的異源性，所以在反應(yīng)過程中會出現(xiàn)擴增效率不一致的問題。

在Real-time qPCR實驗開始之前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因繪制標準曲線，比較兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。

擴增效率測定

相對定量的標準曲線繪制方法與絕對定量基本相似，不同之處是絕對定量中只用構(gòu)建目的基因的標準曲線，而且用于構(gòu)建標準曲線的標準品的量是預(yù)先已知的，而相對定量中需要同時構(gòu)建目的基因和內(nèi)參基因兩條標準曲線，并且相對定量中所用的標準品不需已知其準確的拷貝數(shù)或濃度。

該方法的第一步是制備標準品，通常選擇提取得到的濃度較高的待測樣品RNA即可，將其反轉(zhuǎn)為cDNA后，進行連續(xù)的5倍或10倍梯度稀釋，得到5～6個用于繪制標準曲線的梯度稀釋樣品。

第二步就是分別用梯度稀釋標準品繪制目的基因和內(nèi)參基因的標準曲線，然后根據(jù)標準曲線計算目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率。

參照樣品的選擇

根據(jù)不同的實驗類型，具有以下3種情況：

某處理方法對基因表達的影響，將未處理的樣本作為參照樣本；

檢測基因在不同時間的表達差異，將0時刻的樣本作為參照樣本；

比較基因在不同組織中的表達差異，人為選定一個組織作為參照樣本。