熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線有幾個梯度?

相對定量

相對定量得到的結(jié)果為特定樣本中目的基因相對于另一參照樣本的量的變化。

在某些不需要對基因進(jìn)行絕對定量，只需要確定基因相對表達(dá)差異的情況下，如某樣品在經(jīng)過某種處理后目的基因表達(dá)量是增加了還是減少了，用相對定量的方法就可以得到結(jié)果，相對定量是一種更普遍、更簡單的方法。

內(nèi)參基因

實(shí)驗(yàn)操作中，由于選取樣品時，其細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同、RNA提取的得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中需要使用內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化樣品，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。

相對定量就是通過檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)變化來實(shí)現(xiàn)定量的。

內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內(nèi)參照，常用的內(nèi)參基因有GAPDH基因、β-Actin基因、18S rRNA基因等。

內(nèi)參基因需滿足：

在研究樣本之間的表達(dá)是相似的；

處理因素不會影響其表達(dá)；

與待測基因同時進(jìn)行相同的PCR擴(kuò)增。

盡管在大多數(shù)情況下內(nèi)參基因的表達(dá)非常穩(wěn)定，但是其表達(dá)在某些情況下也會發(fā)生變化，并不是任何內(nèi)參基因都適合任何實(shí)驗(yàn)。在選擇內(nèi)參基因時，應(yīng)仔細(xì)考慮各種因素，選擇合適的內(nèi)參基因或內(nèi)參基因組合。

基因表達(dá)變化倍數(shù)計算方法

比較Ct法是運(yùn)用數(shù)學(xué)公式來計算基因表達(dá)的相對變化量，用該方法進(jìn)行基因表達(dá)定量時，來自于同一樣品的目的基因和內(nèi)參基因都要進(jìn)行Real-Time qPCR反應(yīng)，定量的結(jié)果由目的基因與內(nèi)參基因Ct之間的差值來反應(yīng)。

該方法除了使用內(nèi)參基因以外，還使用了參照樣品，使得能夠比較機(jī)體的不同組織或不同實(shí)驗(yàn)處理組之間的基因表達(dá)變化。

使用該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，但是內(nèi)參基因畢竟與目的基因存在較大的異源性，所以在反應(yīng)過程中會出現(xiàn)擴(kuò)增效率不一致的問題。

在Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)開始之前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。

擴(kuò)增效率測定

相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法與絕對定量基本相似，不同之處是絕對定量中只用構(gòu)建目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先已知的，而相對定量中需要同時構(gòu)建目的基因和內(nèi)參基因兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且相對定量中所用的標(biāo)準(zhǔn)品不需已知其準(zhǔn)確的拷貝數(shù)或濃度。

該方法的第一步是制備標(biāo)準(zhǔn)品，通常選擇提取得到的濃度較高的待測樣品RNA即可，將其反轉(zhuǎn)為cDNA后，進(jìn)行連續(xù)的5倍或10倍梯度稀釋，得到5～6個用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋樣品。

第二步就是分別用梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品繪制目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。

參照樣品的選擇

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)類型，具有以下3種情況：

某處理方法對基因表達(dá)的影響，將未處理的樣本作為參照樣本；

檢測基因在不同時間的表達(dá)差異，將0時刻的樣本作為參照樣本；

比較基因在不同組織中的表達(dá)差異，人為選定一個組織作為參照樣本。