細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟

細(xì)胞爬片免疫熒光步驟：

1.遠(yuǎn)慕生物細(xì)胞爬片；首先是玻片的處理，普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊，先用洗衣粉洗干凈，用水沖靜烤干，然后泡酸過(guò)夜，撈酸后流水洗凈，烤干，置于器皿中高壓滅菌，然后再烤箱中大約8小時(shí)烤干備用。

爬片可以在培養(yǎng)皿 六孔板或24孔板中都可，我選擇在培養(yǎng)皿中爬。一為節(jié)約經(jīng)費(fèi)（培養(yǎng)皿可以重復(fù)利用）二來(lái)覺(jué)得培養(yǎng)皿口大，操作比較方便。培養(yǎng)皿消毒同上，消毒時(shí)記得消兩把鑷子

具體操作是：用胰酶消化好細(xì)胞，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液（注意：這一點(diǎn)很重要，關(guān)系到將來(lái)爬出來(lái)片子的質(zhì)量）

取出消毒的培養(yǎng)皿，可以先加少量培養(yǎng)基（以使玻片與培養(yǎng)皿緊密接觸），將玻片小心放入擺放其中，然后將單細(xì)胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養(yǎng)皿置于37度5％CO2的暖箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間適時(shí)取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然后在4％多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時(shí)操作過(guò)程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。

將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹(shù)膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹(shù)膠徹底干了之后才能做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，要不然玻片會(huì)掉下來(lái)的，就又是前功盡棄了 做好的細(xì)胞爬片可以放在－20保存?zhèn)溆茫唧w能保存多長(zhǎng)時(shí)間不太清楚，當(dāng)然盡量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮)；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封閉30min；

7.加入1%BSA稀釋的一抗，于37℃雜交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀釋的二抗，于37℃雜交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬滅封片劑封片。

抗淬滅封片劑:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油