印跡法(blotting)基本原理和應(yīng)用方法

印跡法(blotting)即轉(zhuǎn)移電泳，是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新方法。Southern于1975年建立了檢測特異DNA片段的DNA- RNA雜交法，稱作Southern印跡法。1977年Alwine等把此方法應(yīng)用到RNA的研究方面，稱作Nouthern印跡法。1979年Towbin等則把該方法擴(kuò)展應(yīng)用到蛋白質(zhì)分析方面，稱作Western印跡法。1982年 Reinhart報(bào)道的雙向蛋白質(zhì)印跡法，稱作Eastern印跡法。目前，有人把Southern，Nouthern，Western印跡法分別稱作DNA印跡法，RNA印跡法和蛋白質(zhì)印跡法。而每一種印跡法又可以分為斑點(diǎn)印跡法和電泳轉(zhuǎn)移印跡法。前者是將樣品直接吸附于固相載體上，而后者則是將樣品先經(jīng)過電泳后在轉(zhuǎn)移到固相載體表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)印跡到固相載體，容易和各種探針發(fā)生化學(xué)或免疫反應(yīng)，因而對檢測樣品(尤其是粗樣品)中某些組分的理化性質(zhì)是有益的。其操作過程所需的試劑量少，靈敏度高，所以應(yīng)用較為普遍。 印跡法的基本原理

(一)概念

1．探針 用化學(xué)方法將有識(shí)別能力的物質(zhì)(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根過氧化物酶)或核素(如3H、35S、32P)，或熒光物質(zhì)(如異硫氰熒光素、地高辛等)結(jié)合成的復(fù)合物稱作探針。

2．固相載體 即用于吸附生命大分子物質(zhì)的固體材料。這類材料有硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜，尼龍膜(nylon- membranes，NDM)，重氮芐氧甲基(yloxymethyl，DBM)膜和重氮芐硫醚(diazophenylthiaether，DPT)紙等。最常用的是孔徑為0．45／lm的NC膜，因?yàn)樗杀镜土Y(jié)合力強(qiáng)，背景較清晰。而對于檢測核酸和酸性蛋白質(zhì)來說，理想載體是帶正電的尼龍膜，它與負(fù)電荷物質(zhì)結(jié)合力很強(qiáng)，操作亦簡單。但因?yàn)槠渑c負(fù)離子型染料也易結(jié)合，背景值高，故使用受到一些限制。

3．封阻 用一種與待測物不反應(yīng)的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸、吐溫20等)封阻載體印跡區(qū)域以外的剩余吸附位點(diǎn)，使探針與印跡物反應(yīng)，且不吸附到載體上，此過程稱為封阻，從而使印跡結(jié)果背景干凈，印跡的斑點(diǎn)或譜帶更為清晰。

4．印跡 把經(jīng)過凝膠電泳后的組分，通過吸附或電泳方法轉(zhuǎn)移或者以直接點(diǎn)樣方式吸附到固相載體上，此過程稱電泳印跡，或稱點(diǎn)印跡。

5．放射自顯影 將含放射性核素的復(fù)合物置X線感光膠片上壓片，當(dāng)放射性核素電離輻射時(shí)，膠片上會(huì)發(fā)生化學(xué)“感光”作用，隨后經(jīng)顯影，定影，即可呈現(xiàn)出斑點(diǎn)或譜帶，此法較靈敏。

(二)原理

生命大分子物質(zhì)(如核酸或蛋白質(zhì))印跡到固相載體上，經(jīng)淬滅試劑處理后，可與相應(yīng)的探針(酶標(biāo)記)反應(yīng)，接著用適當(dāng)?shù)娜芤浩?，置含底物的溶液中顯色，即可現(xiàn)出譜帶。如所用探針為放射性核素標(biāo)記物時(shí)，則應(yīng)將漂洗后的載體進(jìn)行放射自顯影，即可檢測出樣品中特異的成分。

印跡法的應(yīng)用

(一)分析和制備特異成分一般生命大分子如蛋白質(zhì)等的粗制品經(jīng)過凝膠電泳后，常常產(chǎn)生許多譜帶。但它再經(jīng)印跡轉(zhuǎn)移程序分析后，就可以從中找出所需的某一特殊成分，而這種特殊成分又可以從相應(yīng)的凝膠區(qū)段回收。用此方法得到的物質(zhì)純度較高，純化步驟也較簡單。

(二)檢測生命大分子之間的相互作用

不同生命大分子之間的相互作用是經(jīng)常發(fā)生的，特別是在有機(jī)體內(nèi)。因此，建立一種檢測生命大分子物質(zhì)之間相互作用的有效方法一直是人們研究的重要課題。而用印跡法就可以檢測出如DNA-RNA、DNA-蛋白質(zhì)、RNA-蛋白質(zhì)、酶—底物、糖蛋白—凝集素、激素—受體等物質(zhì)之間的相互作用，同時(shí)也可用此方法尋找各種大分子物質(zhì)的相應(yīng)配體。