蛋白質(zhì)樣品中蛋白類雜質(zhì)的檢測(cè)方法

隨著蛋白類生物制品的發(fā)展，蛋白質(zhì)純度已經(jīng)成為藥品管理的重大問(wèn)題。在生物制品的質(zhì)量指導(dǎo)原則中指出：除了評(píng)價(jià)原料藥和藥物產(chǎn)品的純度，可能由預(yù)期產(chǎn)品和多種產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)組成之外，還應(yīng)評(píng)價(jià)可能出現(xiàn)的雜質(zhì)成份。這些雜質(zhì)可能是在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的或者是與產(chǎn)品相關(guān)，它們的結(jié)構(gòu)可能是已知的、定性的，亦或是未知的。

在評(píng)價(jià)樣品純度之前，首先要鑒定待測(cè)雜質(zhì)的類型，如核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、同工酶類、失活蛋白質(zhì)，進(jìn)而確定在待測(cè)溶液中，能夠區(qū)分假定雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(化學(xué)分析或物理特征)。純化過(guò)程中可能已將某一雜質(zhì)的濃度降低到檢測(cè)限以下，但色譜峰中還有殘留。毫無(wú)疑問(wèn)，表觀純度取決于所選擇的測(cè)定方法及其靈敏度。大多數(shù)的分離方法都能有效的去除非蛋白類雜質(zhì)，下面遠(yuǎn)慕生物簡(jiǎn)單介紹蛋白質(zhì)樣品中蛋白類雜質(zhì)的檢測(cè)方法。 1、電泳法

電泳法最簡(jiǎn)單、成本最低，并且在確定樣品中蛋白質(zhì)組分?jǐn)?shù)目方面靈敏度最高，因此最為常見(jiàn)。通常被用于蛋白質(zhì)純度鑒定的第一步篩選，甚至應(yīng)用于初期高異質(zhì)性的樣品鑒定。如果預(yù)期雜質(zhì)與目標(biāo)蛋白的分子量有差距，SDS凝膠電泳可以分辨出雜質(zhì)。對(duì)于分子量相近但氨基酸組成不同的分子，SDS凝膠電泳一般分不開(kāi)，但在非變性凝膠電泳中可以根據(jù)其不同的電泳遷移率進(jìn)行鑒定。

然而，在采用該方法時(shí)也需要注意一些潛在的問(wèn)題。對(duì)于變性凝膠，可能出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性現(xiàn)象。如果發(fā)生雜質(zhì)共遷移或雜質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠的情況，會(huì)出現(xiàn)假陰性。因此應(yīng)該將整塊膠，包括濃縮膠和分離膠都染色，并且需要檢驗(yàn)蛋白質(zhì)燃料是否合適。而假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可能是由于在樣品制備時(shí)發(fā)生共價(jià)修飾，或者膠不均一或氧化劑殘留。同時(shí)在非變性凝膠中也會(huì)出現(xiàn)類似問(wèn)題。如果雜質(zhì)的靜電荷為零或者與目標(biāo)蛋白相反，雜質(zhì)將不會(huì)出現(xiàn)在膠上，可以通過(guò)加寬非變性凝膠電泳的PH范圍來(lái)解決。

2、色譜法

2.1 凝膠過(guò)濾色譜法

凝膠過(guò)濾色譜法是檢測(cè)與目的蛋白分子量大小不同雜質(zhì)的最簡(jiǎn)單方法之一。此方法無(wú)破壞性并且非?？焖?。因?yàn)榇朔椒闃悠穮^(qū)分法，樣品通過(guò)凝膠柱時(shí)會(huì)被稀釋，因此檢測(cè)的樣品需要有一定的起始濃度。而具體的檢測(cè)量則取決于檢測(cè)雜質(zhì)時(shí)的靈敏度。

凝膠過(guò)濾色譜法檢測(cè)分子大小的靈敏度低于電泳法，實(shí)驗(yàn)需要的材料量大于電泳法。由于凝膠過(guò)濾色譜通常在天然狀態(tài)下進(jìn)行，結(jié)果可以反映樣品的異質(zhì)性。但如果蛋白質(zhì)以穩(wěn)定的寡聚物形式存在(如脂肪酸酶)，在凝膠過(guò)濾色譜時(shí)將表現(xiàn)出異質(zhì)性。同時(shí)，快速、可逆自聯(lián)作用的蛋白質(zhì)也會(huì)表現(xiàn)出異常濃度的洗脫譜。在出現(xiàn)這樣情況的時(shí)候，可以從不對(duì)稱或加寬峰中選取不同部分來(lái)重復(fù)凝膠過(guò)濾色譜。

2.2 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法（reversed phase HPLC），是利用如改性硅介質(zhì)等非極性基質(zhì)作為固定相，通過(guò)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑減少了蛋白質(zhì)與固定相的親和力，進(jìn)行極性遞減的梯度洗脫，從而將蛋白洗脫下來(lái)。

由于該方法簡(jiǎn)單并且迅速，同時(shí)有現(xiàn)成的儀器設(shè)備，能夠靈活應(yīng)用于多種不同特性的蛋白質(zhì)分離，因此此方法已普遍用于蛋白質(zhì)樣品的純度測(cè)定。如果有需要，還可以通過(guò)改變流動(dòng)相使樣品在不同梯度及條件下分離，來(lái)確定主要目標(biāo)物的純度。

3、沉降速率測(cè)定法

沉降速度法，能夠簡(jiǎn)單并且快速非破壞性的來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的純度，同時(shí)對(duì)分子質(zhì)量和分子大小的比值非常靈敏。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，測(cè)定范圍非常的廣；但局限在于，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量相差小的樣品做測(cè)定時(shí)，靈敏度低于電泳技術(shù)。

4、質(zhì)譜法

質(zhì)譜法可以直接測(cè)定一個(gè)樣品中共價(jià)質(zhì)量的分布，此方法能夠方便簡(jiǎn)便、靈敏的測(cè)定雜質(zhì)。質(zhì)譜法不僅可以檢測(cè)雜質(zhì)的存在，還可以描述雜質(zhì)的質(zhì)量特征，因此質(zhì)譜法常被用于鑒定雜質(zhì)的來(lái)源。通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS），可以鑒定共價(jià)改性修飾特征和位點(diǎn)。由于雜質(zhì)可能與主要目標(biāo)物有相似的質(zhì)荷比，將質(zhì)譜法與其他方法(如凝膠分離色譜)聯(lián)用，可以增加樣品純度測(cè)定的準(zhǔn)確性，達(dá)到最佳的效果。

5、光散射法

目前一些儀器能夠通過(guò)靜態(tài)或動(dòng)態(tài)光散射來(lái)測(cè)定單個(gè)樣品，或者監(jiān)測(cè)高效液相色譜和場(chǎng)級(jí)分離過(guò)程。通過(guò)對(duì)分子大小和表觀分子質(zhì)量的連續(xù)測(cè)定，增強(qiáng)鑒定洗脫蛋白質(zhì)的能力，以區(qū)分待分析物、待分析物的多聚體或雜質(zhì)。光散射法非常簡(jiǎn)單且無(wú)破壞性，同時(shí)能夠提供洗脫時(shí)間函數(shù)的分子質(zhì)量圖。如果紫外檢測(cè)峰不對(duì)稱，通過(guò)多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析，有可能表現(xiàn)峰的主要部分表觀分子量為mol/L，而邊緣為2mol/L，說(shuō)明可能存在二聚體。但出現(xiàn)倍數(shù)分子質(zhì)量不一定能證明一定存在自身結(jié)合，還需要采用不同的方法驗(yàn)證此結(jié)果。

任何方法都不能直接定量蛋白質(zhì)樣品的純度。通常情況下，蛋白質(zhì)純度測(cè)定涉及評(píng)價(jià)待定雜質(zhì)的含量或僅僅驗(yàn)證蛋白質(zhì)樣品中是否存在雜質(zhì)。無(wú)論最終目的是為了解釋分析數(shù)據(jù)、驗(yàn)證過(guò)程質(zhì)量，還是為了確保生物制劑產(chǎn)品的安全性，樣品純度的測(cè)定都是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。