過氧化物酶活性的測定方法

過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶,它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關(guān)系,在植物生長發(fā)育過程中,它的活性不斷發(fā)生變化,因此測量這種酶,可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化.

一、原理
在有過氧化氫存在下,過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化,生成茶褐色物質(zhì),該物質(zhì)在 470 nm 處有最大吸收,可用分光光度計測量 470 nm 的吸光度變化測定過氧化物酶活性.

二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備

（一）實驗材料
馬鈴薯塊莖.

（二）試劑
1 ． 100 mmol ／ L 磷酸緩沖液 pH6.0 （見附錄）.
2 ．反應(yīng)混合液：100 mmol ／ L 磷酸緩沖液（ pH6.0 ） 50 mL 于燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚 28 μl ,于磁力攪拌器上加熱攪拌,直至愈創(chuàng)木酚溶解,待溶液冷卻后,加入 30 % 過氧化氫 19 μl ,混合均勻,保存于冰箱中.

（三）儀器設(shè)備
分光光度計,研缽,恒溫水浴鍋,100 mL 容量瓶,吸管,離心機.

三、實驗步驟

1 ．稱取植物材料 1 g ,剪碎,放入研缽中,加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿,以 4000 r ／ min 離心 15 min ,上清液轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中,殘渣再用 5 mL 磷酸緩沖液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,貯于低溫下備用.
2 ．取光徑 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反應(yīng)混合液 3 mL 和磷酸緩沖液 1mL ,作為對照,另 1 只中加入反應(yīng)混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性過高可稀釋之）,立即開啟秒表記錄時間,于分光光度計上測量波長 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 讀數(shù)一次.

四、結(jié)果計算

以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小,即以 ΔA 470 /[min ? g （鮮重） ] 表示之.也可以用每 min 內(nèi) A 470 變化 0.01 為 1 個過氧化物酶活性單位（ u ）表示.
過氧化物酶活性 [u/ （ g ? min ） ]=式中：Δ A 470 ——反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化.W ——植物鮮重,g .
V T ——提取酶液總體積,mL .
V s ——測定時取用酶液體積 ,mL .
t ——反應(yīng)時間,min .