遠(yuǎn)慕簡述巨噬細(xì)胞的分離和純化

1、取2～3公斤重的家兔，耳緣靜脈注射10ml空氣處死動(dòng)物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉動(dòng)物。仰臥固定，消毒胸部，剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結(jié)締組織。用無菌紗布小心擦凈肺表面，稱重。

2、分離肺泡巨噬細(xì)胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射40ml無菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進(jìn)入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用40ml無菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3、分離肺組織中的巨噬細(xì)胞：取出肺泡巨噬細(xì)胞后，剪去氣管，將肺組織放在有冷RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿冷RPMI-1640培養(yǎng)液的20ml注射器接23號(hào)針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過00目的鋼絲網(wǎng)，分離單細(xì)胞。

4、以下過程均在4℃中進(jìn)行。分別處移動(dòng)圖片理肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織中的巨噬細(xì)胞：離心200×g10分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細(xì)胞，加入10ml低滲液（20mmol/LTris,0.75%氯化銨，pH7.4），37℃處理3～5分鐘，溶解紅細(xì)胞。紅細(xì)胞通常分別占肺泡巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的1%和10%。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細(xì)胞分離液上分離巨噬細(xì)胞。

5、離心200×g10分鐘，去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次。將細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液（比重1.077）上，離心400×g20分鐘，收集交界面的巨噬細(xì)胞。棄去沉淀的死細(xì)胞和紅細(xì)胞。

6、用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌巨噬細(xì)胞2次。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞配成所需濃度。此時(shí)巨噬細(xì)胞活力可達(dá)90%以上，巨噬細(xì)胞占全部細(xì)胞的90%以上。