蛋白質(zhì)的分離純化方法以及注意事項

蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項重要的操作技術(shù)。 一個典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來。 一、主要方法
1. 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離（利用顆粒不同程度的顆粒吸附力來使分離的目的達(dá)到）。
2. 按照配體特性的分離-親和層析（利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子能夠特異結(jié)合這一生物性質(zhì)）
3. 低溫有機(jī)溶劑沉淀法，使用如甲醇，乙醇等與水可混溶的有機(jī)溶劑，降低多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度并且將其析出，和鹽析相比較，這種方法的分辨率更加的高，然而蛋白質(zhì)比較容易變形，需要在低溫下進(jìn)行。
4. 按照分子大小不一樣的方法，密度梯度離心（在介質(zhì)中對蛋白質(zhì)離心時，蛋白質(zhì)沉降速度取決于它的質(zhì)量和密度，質(zhì)量和密度越大，那么沉降越快；凝膠過濾（一種柱層析）；超過濾（利用蛋白質(zhì)分子不能從半透膜通過的性質(zhì)）。
5. 按照溶解度差異分離，等電點沉淀法鹽溶與鹽析（使用一定濃度鹽溶液來使蛋白質(zhì)的溶解度增大或減?。?；（因為在等電點時蛋白質(zhì)分子的凈電荷為0，使分子間靜電斥力減少了，所以，聚集沉淀比較容易，這時具有最小的溶解度）。
6. 按照電荷不同的分離方法。主要分為離子交換層析和電泳分離。

二、操作步驟：
1. 所有在純化系統(tǒng)里使用的溶液當(dāng)日都需要經(jīng)過0.22μm的濾膜抽濾、脫氣處理；保存4℃冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需恢復(fù)至室溫后抽濾脫氣；
2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過濾，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、緩沖液洗泵；設(shè)置流速和柱前警報壓（壓力值參閱層析柱及填料說明書，取較小的一個最大耐受壓力）。防止柱中進(jìn)入氣泡，影響分離效果；
4. 當(dāng)柱子限壓在0.3MPa，或者在限壓狀態(tài)下流速很低時，pH valve 中的Restirtor 可以切換成Off line，即顯示By-pass狀態(tài)；
5. 當(dāng)需要通過儀器上樣環(huán)上樣時，將W1閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過注射器倒吸樣品上樣；
6. 進(jìn)樣閥“Inject”為上樣狀態(tài)。上樣結(jié)束可將進(jìn)樣閥切換回“Load”狀態(tài)。并用純水認(rèn)真清洗上樣環(huán)至少3次；將W1閥口處換回原來接頭閥門。
7. 純化結(jié)束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用20%的乙醇清洗泵以及系統(tǒng)。長期不用，層析柱應(yīng)保存在20%的乙醇中，泵放置在20% 乙醇中；
8. 實驗結(jié)束后及時傾倒廢液瓶里的廢液；

三、注意事項
1.為了避免蛋白質(zhì)變性，不要對樣品劇烈攪動和反復(fù)凍融。
2.緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)。。
3.為了避免蛋白質(zhì)的氧化，將0.1~1mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或β-巰基乙醇）加入到緩沖溶液中。
4.為了避免重金屬對目標(biāo)蛋白的破壞，將1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑加入。
5.為了避免微生物生長，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質(zhì)的時候，均必須時刻對它的穩(wěn)定性注意維護(hù)，使它的活性得到保護(hù)，需要牢記如下一些通用的注意事項。
6.盡可能置于冰上或者在冷庫內(nèi)進(jìn)行操作。
7.蛋白濃度不要太稀。
8.除非是進(jìn)行聚焦層。否則pH需要合適，防止所使用的緩沖溶液pH與pI相同，使蛋白質(zhì)的沉淀得以避免。
9.使用蛋白酶抑制劑，避免蛋白酶對目標(biāo)蛋白的降解；在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時，將DNA酶加入來使得DNA降解，避免DNA對蛋白的污染。