PCR技術(shù)中常用的耐熱DNA聚合酶介紹

耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除 錯(cuò)配，切 平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類，下面遠(yuǎn)慕生物簡單介紹一下。 一、普通耐熱DNA聚合酶

Taq DNA 聚合酶

由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達(dá)200,000單位/mg。具有5'-3'外切酶活性，但不具有3'-5'外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯(cuò)配沒有校正功能。

TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3'加入單 核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾；另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將 平端的 質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3'端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的 T-A克隆法。

Tth DNA 聚合酶

從Thermus thermophilus HB8中提取而得，該酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地 逆轉(zhuǎn)錄RNA；當(dāng)加入Mg2+后，該酶的聚合活性大大增加，從而使cDNA合成與擴(kuò)增可用一種酶催化。

二、高保真DNA聚合酶

pfu DNA 聚合酶

是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正 PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，使產(chǎn)物的 堿基 錯(cuò)配率極低。PCR產(chǎn)物為 平端，無3'端突出的單A核苷酸。

Vent DNA 聚合酶

該酶是從Litoralis棲熱球菌中分離出的，不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基，具有校對功能。

三、DNA序列測定中應(yīng)用的耐熱DNA聚合酶

測序級(jí)TaqDNA聚合酶

是在TaqDNA聚合酶的基礎(chǔ)上對它進(jìn)行修飾，去除5'-3'外切酶活性，保證測序記過的高度準(zhǔn)確性，可產(chǎn)生強(qiáng)度均一的測序條帶，背景清晰。

Bca Best DNA 聚合酶

從Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提純，并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸長性能優(yōu)越；可抑制 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，可以得到均一的DNA測序帶。

Sac DNA 聚合酶

從酸熱浴流化裂片菌中分離，無3'-5'外切酶活性，可用于DNA 測序，但測序反應(yīng)中ddNTP/dNTP的比率要高。