層析法的原理、分類以及應(yīng)用介紹

層析法利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)間的差異（溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等），使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

層析法進(jìn)行時有兩個相，一個相稱為固定相，另一相稱為流動相。由于各組分所受固定相的阻力和流動相的推力影響不同，各組分移動速度也各異，從而使各組分得到分離。

層析技術(shù)與待分離混合物中各組分的理化性質(zhì)（分子自然形狀、大小、獲電狀態(tài)、溶解度與選擇性吸附劑或載體物的吸附能力，分配系數(shù)、酸堿環(huán)境、溫度、極性以及分子的親和能力等）有著直接關(guān)系。除此，任何層析技術(shù)，均具有兩相條件，造成流動相對固定相作單向相對運(yùn)動。這種流動相推動樣品中各組分通過固定相向前遷移，其運(yùn)動速率與兩相物質(zhì)和被分離物質(zhì)狀態(tài)有關(guān)。由于被分離物各組分中的理化性質(zhì)不同，對不同的兩組或兩組以上組分，具有不同的作用力，通過吸附一解吸，或離子交換、分子篩效應(yīng)、靜電引力，免疫特異性吸附等，造成各組間生物分子分離、遷移距離不等，最終達(dá)到被測物的分離、純化的目的。這一技術(shù)的應(yīng)用，不但能分離有機(jī)化合物，還能分離無機(jī)物，更主要的是適合于分離分析生物高分子物質(zhì)，其分離范圍廣，適用性強(qiáng)。化學(xué)性穩(wěn)定、靈敏度高，既可純化又可制備，條件簡便。
層析法分類如下：

1.凝膠層析

又稱分子篩過濾或排阻層析等。

固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度（移動速度）也不同。

優(yōu)點(diǎn)：所用凝膠屬于惰性載體，吸附力弱，操作條件溫和，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很好的分離效果。

常用的凝膠有Sephadex G（葡聚糖凝膠）系列。

凝膠層析可用于脫鹽、分離提純、測定高分子物質(zhì)的分子量、高分子溶液的濃縮等。

2.離子交換層析

采用具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進(jìn)行可逆交換的性質(zhì)來分離離子型化合物的方法。

主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其他帶電荷的生物分子。

3.高效液相層析

在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)氣相層析的理論而發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎快速的分離技術(shù)。

具有分離能力強(qiáng)、測定靈敏度高、可在室溫下進(jìn)行、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，對分離蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等尤其有利。

根據(jù)流動相和固定相相對極性，高效液相色譜分析可分為正相和反相兩種。

4.親和層析

利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離的目的。

將可親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含混合組分的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)才能被固定相吸附結(jié)合，無關(guān)組分隨流動相流出。

親和層析中所用的載體稱為基質(zhì)，與基質(zhì)共價連接的化合物稱配基。

具有專一親和力的生物分子對主要有：

抗原與抗體，DNA與互補(bǔ)DNA或RNA，酶與底物，激素與受體，維生素與特異結(jié)合蛋白，糖蛋白與植物凝集素等。

親和層析可用于純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏、分離核酸等。