蛋白分離純化方法之免疫親和層析法

親和層析法是重組蛋白純化的重要方法之一，被廣泛應(yīng)用蛋白質(zhì)的研究領(lǐng)域，是分離純化和分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的有力工具。免疫親和層析是親和層析方法的一種，該方法利用抗體與其相應(yīng)抗原的作用具有高度的特異性和高度結(jié)合力的特點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到層析載體上，便可有效的分離和純化各自互補(bǔ)的免疫物質(zhì)。

目前在重組蛋白純化中已經(jīng)使用單克隆抗體作為親和配體的親和層析方法，利用抗體-抗原模式，有可能得到每一種目標(biāo)蛋白的單抗，然后以單抗為配基，通過親和層析技術(shù)分離純化重組蛋白。該種方法的純化配屬和活性回收率較高。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗體與蛋白A或蛋白G微珠共價交聯(lián)后更容易與抗原結(jié)合。將具有良好抗原結(jié)合特性，且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種實(shí)用和有效的重組蛋白純化方法。

重組蛋白技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)晶、蛋白質(zhì)藥物、蛋白質(zhì)相互作用及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有非常重要的作用。遠(yuǎn)慕生物在重組蛋白表達(dá)與純化服務(wù)方面經(jīng)驗(yàn)豐富，擁有多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)，包括原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)、酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)（桿狀病毒）和哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具備多種融合技術(shù)，可以為客戶在蛋白表達(dá)與純化方面提供多種選擇。
1、小鼠腹水中JWA單克隆抗體制備的研究

JWA是一種新的微管結(jié)合蛋白，不僅參與全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)的細(xì)胞分化調(diào)節(jié)，而且與多種細(xì)胞分化、凋亡誘導(dǎo)劑的生物學(xué)作用有關(guān)，涉及相應(yīng)的信號通路。JWA可以調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的分化，還可以通過絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號通路調(diào)節(jié)腫瘤，如宮頸癌、乳腺癌和肝癌等細(xì)胞的遷移。JWA還活躍地參與細(xì)胞對應(yīng)激刺激，如冷應(yīng)激、熱應(yīng)激和化學(xué)物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激等的應(yīng)答。

有研究者建立小鼠腹水中JWA單克隆抗體(Monoclonalantibody，mAb)的制備方法及鑒定，獲得高純度、高效價的JWA單克隆抗體。首先對預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理的小鼠腹腔接種JWA單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，收集小鼠腹水、離心，采用ProtienG親和柱層析法進(jìn)行親和層析純化JWA單克隆抗體，并采用SDS-PAGE檢測方法分析純化抗體的純度。分別運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光、免疫印跡技術(shù)鑒定純化的抗體特異性。BCA法測定純化后JWA單抗的濃度為6.79mg/mL;SDS-PAGE電泳顯示純化的抗體只有IgG的重鏈和輕鏈，而沒有其它雜蛋白帶；純化后的JWA單抗在免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以檢測到細(xì)胞中JWA蛋白在胞漿中呈絲狀均勻分布，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)中1∶800、1∶400均可以得到清晰的目的條帶。用ProteinG親和層析法獲得了高純度和較高效價的JWA單克隆抗體，這將為JWA蛋白的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供技術(shù)支持。

2、免疫親和層析方法的特點(diǎn)

免疫親和層析作為一種重組蛋白純化方法，也是一種既簡單又非常有效的分離抗原的技術(shù)。即將抗體共價結(jié)合到一種惰性的微珠上，然后將微珠與含有待純化抗原的溶液混合。當(dāng)抗原被交聯(lián)在微珠上的抗體捕獲后，通過洗滌去除無關(guān)的抗原，然后用洗脫緩沖液處理微珠，結(jié)合的抗原被洗脫，從而得到純化的抗原。如果洗脫條件掌握較好而且比較溫和，純化的抗原仍能保持其天然狀態(tài)。雖然下述的所有實(shí)例都是以蛋白質(zhì)抗原作為研究對象，但凡是能與抗體有效結(jié)合的分子都能用這種方法進(jìn)行純化。

免疫親合層析具有以下特點(diǎn)：

（1）抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特異性，能大量分離天然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原；

（2）不是所有的抗體都適用于免疫親和層析，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡單、快速、可靠；

（3）可按照不同規(guī)模進(jìn)行，半天內(nèi)即可完成，而且可以獲得其他層析法不可比擬的純化效果；

（4）經(jīng)過簡單的改進(jìn)，免疫親和層析法也可用于純化針對抗原的特異性抗體。

影響免疫親和層析純化的因素主要有3個：首先是抗原或抗體的初濃度，其次是兩者之間的親和力，再次是抗原抗體是否容易解離。有研究者利用吸附層析結(jié)合免疫親和層析的方法分離純化得到一種蛋白復(fù)合體，該復(fù)合體含有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的輔阻遏物蛋白SMRT和N-CoR。還有研究者利用免疫親和層析從病人的血清中純化出抗神經(jīng)酰胺單己糖（CMH）的特異性抗體。

為了發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)治療疾病的蛋白，人們有必要進(jìn)行重組蛋白純化。傳統(tǒng)的純化規(guī)程正被高度選擇性和成熟的以親和層析為基礎(chǔ)的策略所代替，親和層析可能是現(xiàn)行僅有的著重于高通量和擴(kuò)大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)鍵問題的分離技術(shù)，主要的問題是設(shè)計新的技術(shù)來確定與假設(shè)目標(biāo)相結(jié)合的高選擇性的親和配體。利用理性和組合的方法設(shè)計具高選擇性和穩(wěn)定性的配體對于親和層析未來的應(yīng)用會有巨大的影響。