你不得不知的RNA磷酸酶/外切酶/激酶知識

RNA核酸外切酶

Terminator 5'-Phosphate-Dependent Exonuclease

Terminator Exonuclease是一種5’→ 3’進行性核酸外切酶，可降解帶有5’單磷酸的RNA。它不會降解具有5’三磷酸、5’-帽結構(例如大多數(shù)真核mRNA帶有的5’-帽結構)或5’OH的RNA。它也消化帶有5’單磷酸的DNA。該酶不受蛋白形式的RNase抑制劑的抑制。

應用：

● 鑒定RNA轉錄本的5’末端；

● 富集mRNA樣品，無需使用oligo(dT)、樹脂或磁珠去除rRNA；

RNA磷酸化酶

RNA 5’ Polyphosphatase

RNA 5’ Polyphosphatase是Epicentre科學家發(fā)現(xiàn)的一個Mg2+依賴的磷酸水解酶。該酶能夠從5’-三磷酸化的RNA (如初級RNA轉錄本) 依次地移除γ和β磷酸基：

5’ pppN—OH 3’ → 5’ pN—OH 3’ + 2 Pi

帶有5’-雙磷酸化末端的RNAs也可以通過RNA 5’ Polyphosphatase轉化成5’-單磷酸酶化的RNA：

5’ ppN—OH 3’ → 5’ pN—OH 3’ + Pi

RNA 5’ Polyphosphatase對含有5’帽子(例如, 5’ m7GpppN—OH 3’)或5’單磷酸化末端(5’ pN—OH 3’)的RNA沒有活性。但是NTPs和dNTPs都是該酶的底物，產(chǎn)生相應的NMPs和dNMPs + 無機磷:

(d)NTP → (d)NMP + 2Pi

應用：

● 將5’三磷酸化的RNA轉換成5’單磷酸化的RNA，用于使用T4 RNA Ligase的5’-RNA連接標記反應；

● 分析RNA的5’末端結構；

● 用于制備RNA底物，后續(xù)可用于Terminator 5’-Phosphate-Dependent Exonuclease的降解反應。

RNA聚合酶

T7 RNA Polymerase

T7 RNA聚合酶是一種高度特異性識別T7啟動子序列的DNA依賴的5’→3’RNA聚合酶，可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動子下游NTP的摻入，合成與T7啟動子下游的模板DNA互補的RNA。

應用：RNA體外轉錄，合成mRNA。

RNA連接酶

T4 RNA Ligase

T4 RNA連接酶，是一種ATP-依賴的可以催化單鏈RNA、單鏈DNA或單核苷酸分子間或分子內(nèi)5’-P末端與3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵的酶。

應用：RNA和RNA之間的連接，連接時需要5’磷酸基團和3’羥基的存在。不僅可以進行RNA分子間的連接，也可以進行RNA分子(最短8個堿基)的環(huán)化連接。

RNA相關激酶

T4 Polynucleotide kinase

T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK酶）可催化ATP分子上γ位磷酸基團向單鏈、雙鏈RNA分子和DNA分子的5’-羥基末端上轉移以及向3’-單磷酸核苷上轉移。T 多聚核苷酸激酶還具有 3’磷酸酶活性。

應用：

● 在NGS應用中，主要用于文庫構建過程中末端修飾中的5’磷酸化修飾；

● DNA及RNA 5’末端的標記，用于DNA測序、印跡雜交實驗等。