你不得不知的RNA磷酸酶/外切酶/激酶知識(shí)

RNA核酸外切酶

Terminator 5'-Phosphate-Dependent Exonuclease

Terminator Exonuclease是一種5’→ 3’進(jìn)行性核酸外切酶，可降解帶有5’單磷酸的RNA。它不會(huì)降解具有5’三磷酸、5’-帽結(jié)構(gòu)(例如大多數(shù)真核mRNA帶有的5’-帽結(jié)構(gòu))或5’OH的RNA。它也消化帶有5’單磷酸的DNA。該酶不受蛋白形式的RNase抑制劑的抑制。

應(yīng)用：

● 鑒定RNA轉(zhuǎn)錄本的5’末端；

● 富集mRNA樣品，無(wú)需使用oligo(dT)、樹(shù)脂或磁珠去除rRNA；

RNA磷酸化酶

RNA 5’ Polyphosphatase

RNA 5’ Polyphosphatase是Epicentre科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Mg2+依賴的磷酸水解酶。該酶能夠從5’-三磷酸化的RNA (如初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本) 依次地移除γ和β磷酸基：

5’ pppN—OH 3’ → 5’ pN—OH 3’ + 2 Pi

帶有5’-雙磷酸化末端的RNAs也可以通過(guò)RNA 5’ Polyphosphatase轉(zhuǎn)化成5’-單磷酸酶化的RNA：

5’ ppN—OH 3’ → 5’ pN—OH 3’ + Pi

RNA 5’ Polyphosphatase對(duì)含有5’帽子(例如, 5’ m7GpppN—OH 3’)或5’單磷酸化末端(5’ pN—OH 3’)的RNA沒(méi)有活性。但是NTPs和dNTPs都是該酶的底物，產(chǎn)生相應(yīng)的NMPs和dNMPs + 無(wú)機(jī)磷:

(d)NTP → (d)NMP + 2Pi

應(yīng)用：

● 將5’三磷酸化的RNA轉(zhuǎn)換成5’單磷酸化的RNA，用于使用T4 RNA Ligase的5’-RNA連接標(biāo)記反應(yīng)；

● 分析RNA的5’末端結(jié)構(gòu)；

● 用于制備RNA底物，后續(xù)可用于Terminator 5’-Phosphate-Dependent Exonuclease的降解反應(yīng)。

RNA聚合酶

T7 RNA Polymerase

T7 RNA聚合酶是一種高度特異性識(shí)別T7啟動(dòng)子序列的DNA依賴的5’→3’RNA聚合酶，可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動(dòng)子下游NTP的摻入，合成與T7啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。

應(yīng)用：RNA體外轉(zhuǎn)錄，合成mRNA。

RNA連接酶

T4 RNA Ligase

T4 RNA連接酶，是一種ATP-依賴的可以催化單鏈RNA、單鏈DNA或單核苷酸分子間或分子內(nèi)5’-P末端與3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵的酶。

應(yīng)用：RNA和RNA之間的連接，連接時(shí)需要5’磷酸基團(tuán)和3’羥基的存在。不僅可以進(jìn)行RNA分子間的連接，也可以進(jìn)行RNA分子(最短8個(gè)堿基)的環(huán)化連接。

RNA相關(guān)激酶

T4 Polynucleotide kinase

T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK酶）可催化ATP分子上γ位磷酸基團(tuán)向單鏈、雙鏈RNA分子和DNA分子的5’-羥基末端上轉(zhuǎn)移以及向3’-單磷酸核苷上轉(zhuǎn)移。T 多聚核苷酸激酶還具有 3’磷酸酶活性。

應(yīng)用：

● 在NGS應(yīng)用中，主要用于文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中末端修飾中的5’磷酸化修飾；

● DNA及RNA 5’末端的標(biāo)記，用于DNA測(cè)序、印跡雜交實(shí)驗(yàn)等。