離子交換柱層析法（層析實驗簡介）概略

一、    原理：

有些高分子物質(zhì)含有一些可以分離的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的離子產(chǎn)生交換反應(yīng)。如：

R-SO3H＋M+ ———— R-S3M＋H+

或R-NH3OH＋CL－  —————  R-NH3CL＋OH－

這類高分子物質(zhì)通稱離子交換劑，其中使用最普遍的是離子交換樹脂。由于一定的離子交換劑對不同離子的親和力不同，因此在洗提過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后得到分離。

二、    目的與要求：

本實驗是采用Zerolit225型陽離子交換樹脂所裝的柱，選以特定的PH緩沖洗脫液來分離含有兩個性質(zhì)不同的氨基酸溶液。通過實驗要求掌握裝柱、上樣、洗脫、收集等離子交換柱層析技術(shù)的要點。

三、儀器與裝置：

玻璃層析柱：長475px，內(nèi)徑30px，3# 砂芯。

HL-2B型恒流泵。

HD-4型電腦核酸蛋白檢測儀。

BS-100A自動部份收集器。

250ml燒杯。

1ml吸管。

水浴鍋。

72型（或721型）分光光度計。

四、    試劑與藥品：

樹脂：Zerolit225型陽離子交換樹脂。

洗脫液：0.45N，PH5.3檸檬酸緩沖液，取285g檸檬酸（C6O7H8·H2O）；186g 97℅NaOH；105ml濃硫酸溶于水中稀釋至10升。

樣品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。

顯色劑：顯色劑列出兩種可任選一種。

顯色劑（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。

10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%）

顯色劑（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。

0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀釋至250ml

A、將1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）濃度的溶液。

B、將2.5ml 0.01M KCN溶液與125ml乙醇甲醚混合。將A和B合并置棕色瓶中過夜即可使用。此溶劑用時，A、B兩溶液在前一天合并，配好的溶液僅能在1-2天內(nèi)使用，過時失效須重配。

五、方法與步驟：

1、樹脂的處理：

關(guān)于市售新樹脂的處理見7、，本實驗采用處理好的樹脂。

2、裝柱：將層析柱垂直裝好，關(guān)閉柱底出口，在柱內(nèi)注入約25px高的檸檬酸緩沖液。

將經(jīng)處理已成鈉型的樹脂置于燒杯中，加進(jìn)1倍體積的檸檬酸緩沖液，攪成懸浮狀沿柱內(nèi)壁細(xì)心地把柱灌滿。倒時不要太快，以免產(chǎn)生泡沫。待樹脂在柱底逐漸沉積至約25px高時，用吸管吸去柱內(nèi)上層所出現(xiàn)的清液，慢慢打開柱底出口，繼續(xù)加注樹脂懸液直至柱體裝到200px高度為止。

在裝柱時要避免使柱內(nèi)液體流干而使裝柱失敗，另外樹脂懸浮液的溫度要相對恒定（特別是對于采用高溫法）。裝好的柱體應(yīng)該沒有紋路，沒有節(jié)痕，沒有氣泡，柱頂表面平整而均勻。如此，方可投入使用，否則須要重裝。

3、平衡：

柱裝好后接上調(diào)好流速的恒流泵或恒壓洗脫瓶，用檸檬酸緩沖洗脫液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的PH與洗脫液的PH相同為止，這大約需要2-3倍床體積。

4、加樣與洗脫：

移去柱上加液器塞，打開柱底出口，小心使柱內(nèi)液體流至體表面時即行關(guān)閉。用加樣吸管吸取0.5ml氨基酸酸混合樣品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加樣不要過快，以免沖壞樹脂表面，加樣后慢慢打開柱底閥，使液面再與樹脂面相齊時關(guān)閉，然后再用吸管吸取適量洗脫液，如此清洗柱內(nèi)壁四周2-3次。洗滌后，用緩沖液在柱內(nèi)加至2-75px高的液層，然后接上加液器，調(diào)好流速（24ml/hr）即開始洗脫。

注意在調(diào)節(jié)流速時要排除掉恒流泵或恒壓瓶與柱之間連接管內(nèi)的所有氣泡。并且在調(diào)節(jié)時不要過猛，以免影響層析行為。

5、收集：柱流液可用自部分收集器約收20管。

6、測定：

將收集的各管編號后，分別取0.5ml收集液于一潔凈的干試管中，加入1ml洗脫緩沖液；0.5mlKCN茚三酮試劑，混合后在100℃水浴加熱25分鐘，然后水冷卻5-10分鐘，加3ml 60%乙醇稀釋，搖勻后用72型或721型分光光度計在570nm處比色。

測定后，以光吸收為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)或ml數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

7、再生：

對于裝好的柱使用幾次后需要0.2N NaOH溶液洗脫，再用蒸餾水洗至中性后重復(fù)使用。

對于市售的干樹脂其處理方法為：先經(jīng)水充分溶張后，傾泌去除細(xì)粒并使水澄清。然后經(jīng)浮選得到顆粒大小合適的樹脂，浮先后用4倍量的2N HCL和2N NaOH依次浸洗，每次半小時，換酸或堿時要用水將樹脂洗至中性，最后樹脂應(yīng)處理至溶液無黃色。這時再用1N NaOH使樹脂轉(zhuǎn)成鈉型（對于基它的轉(zhuǎn)型要視實驗和樹脂的情形而定），以蒸餾水洗至中性備用。

對于不知或難以估計層析行為的樣品層析時，要采用逐管收集測定跟蹤法，以便掌握層析的結(jié)果。

氨基酸測定一般在1PH左右，在本實驗中因緩沖液的PH就為5.3，因此可直接測定。但如果PH偏差要求太大，則可以加1ml、2N，PH5.5醋酸緩沖液，以保證測定條件。