高效液相色譜外標法含量計算注意事項

HPLC法在研究中的應用就是含量測定了，HPLC法應用于含量測定時哪些需要注意的問題？外標法含量計算方式有哪些注意事項是必知的？

除鑒別和有關物質(zhì)檢查外，HPLC法在化學藥物中的應用就是含量測定了，另外在制劑的含量均勻度、溶出度、釋放度檢驗項目中，HPLC法也發(fā)揮著越來越重要的作用，但其本質(zhì)與含量測定一樣，都是準確定量的測定方法，因此，含量測定也包括含量均勻度、溶出度、釋放度等定量檢測項目。
1、HPLC法應用于含量測定時需要注意的問題
在建立一個新的HPLC法含量測定方法時，方法建立以及方法學驗證方案需要特別考慮下述多種因素對分析結(jié)果的影響。

（1）流動相緩沖鹽的pH值
流動相緩沖鹽的pH值對藥物的保留行為有影響，甚至會顯著改變某些堿性藥物的保留行為。當流動相中緩沖溶液的pH為3.0時，出峰順序為利多卡因、苯甲酰胺、酮洛芬，當流動相中緩沖溶液的pH為10.0時，三種藥物的出峰順序為酮洛芬、苯甲酰胺、利多卡因二即使是梯度洗脫，流動相中緩沖溶液的pH值仍然對藥物的保留行為產(chǎn)生影響。

(2)色譜柱
色譜柱的差異也會影響藥物的保留行為，即使是柱長、內(nèi)徑、粒徑相同的色譜柱，由于填料性質(zhì)的差異，藥物的保留時間、峰型有時會有較大差異。

(3)流動相組成
以多元維生素制劑的含量測定為例，某制劑中含有4種維生素：煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1。如圖2所示，當流動相中己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉的相對比例由1:1變?yōu)?:6時，不僅各組分的保留時間、峰形有變化，甚至峰3、峰4沒有實現(xiàn)分離。

2、含量的計算方式
HPLC的定量方法可以分為內(nèi)標法和外標法。在儀器發(fā)展的初期，由于進樣重復性差。為了保證測定結(jié)果的準確采用內(nèi)標法較多。隨著自動進樣裝置的發(fā)展，進樣的重復性已經(jīng)足夠精密，從90年代開始，大部分的內(nèi)標法已經(jīng)被外標法取代。

但是，在藥典制劑品種中還有一定數(shù)量的HPLC含量測定方法采用內(nèi)標法。除了尚未修訂以外，以前擔心的進樣重復性已經(jīng)不是采用內(nèi)標法的原因，主要是因為藥品制劑含量測定中樣品回收率或樣品制備方法的回收率影響，供試品溶液在萃取、離心處理或其他樣品溶液制備過程中不能保證樣品的完全提取，以及輔料對低含量藥物的吸附作用，采用內(nèi)標法可避免因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。

3、外標法含量計算方式注意事項
外標法含量計算公式：含量=m對*P*A樣*V樣/（m樣*A對*V對）*100%

（1）樣品稱樣量
a、稱量方式采用的是加量法還是減量法，都是很有講究的。正常情況下，肯定要采用加量法，一次稱取到位，這樣才能得到準確的稱樣量。

b、稱量操作稱量時，是否足夠小心，不會在轉(zhuǎn)移樣品時使樣品撒漏，這個是非常重要的。

c、樣品如果具有揮發(fā)性，直接稱樣時，必然會揮發(fā)一部分造成誤差；另外，如果樣品不穩(wěn)定，或在溶液中不穩(wěn)定，那么實際上來講，也是影響了樣品量。還有，樣品要保證均勻，固體不必說，液體樣品要保證是均相，稱量之前要搖勻。

（2）對照品含量
a、對照品質(zhì)量對照品是否有合法來源，其含量值是否準確。

b、對照品的保存對照品是否按要求保存，也是至關重要的。因為如果對照品沒有按照規(guī)定保存，那么其右可能會發(fā)生降解，進而影響含量值；另外，如果對照品是保存在冰箱中，稱量時，應取出放在干燥器中回至室溫再稱量，否則其很有可能會吸收空氣中的水分，影響含量值。同理，如果對照品引濕性很強的話，長期暴露在空氣中，也會使其P發(fā)生變化。

（3）樣品峰面積
a、如果所用的分析方法可靠性不好，樣品峰面積或保留時間容易變化，那么檢測結(jié)果也是很重現(xiàn)性不好的。

b、如果儀器系統(tǒng)被污染產(chǎn)生殘留，而本身峰面積就不大的情況下，這個因素產(chǎn)生的誤差就更明顯了。

c、如果樣品峰形不夠好，或者分離度不夠好的情況下，積分就很重要。

（4）樣品的稀釋體積
a、容量瓶、移液管等體積是否準確。一般來說，新買的容量瓶體積是符合要求的，但是也難免會買到個別次品，這就需要進行校驗了。

b、容量瓶、移液管規(guī)格。這個是很重要的，一般大家都能注意這個問題，做到合理使用。

c、試驗習慣問題，容量瓶在使用時，不能使其至于高于40攝氏度的環(huán)境下，否則容量瓶會發(fā)生變形。

d、定量操作，這個包括容量瓶和移液管的使用，注意事項：
一是移液管吸液時，液面不要高刻度太多，放液時千萬不要用洗耳球吹，并且盡量保持每次操作時間都一樣，粘度大的溶液尤其需要如此。
二是觀察液面時，要使容量瓶和移液管保持垂直，這時很多人喜歡用三根手指捏住，其實這樣不容易保持垂直，最好用兩根手指，輕輕捏住就好。
三是注意接觸容量瓶移液管等的面積越小越好，以免體溫加熱溶液。

e、如果對照品和樣品沒有用同一份稀釋劑稀釋的話，兩者就會有差異，受到溫度變化的影響也是不一樣的。比如，所用的稀釋劑為水：甲醇=50：50，對照溶液用的是上次配好的，然后樣品用的是新配的，因為水和甲醇混合會放熱，其體積也會增大，等到進樣時，樣品溶液回至室溫，體積減小，就會造成檢測結(jié)果偏高。

f、如果前后室溫變化的話，也會造成分析結(jié)果的誤差。比如，對照溶液進樣時，是正常上班時間，實驗室開了空調(diào)，溫度為20℃，而到樣品溶液進樣時，已經(jīng)到下班時間了，實驗室人員下班時將空調(diào)關閉，實驗室溫度已經(jīng)降為10℃，這時樣品溶液濃度肯定也會增大。

g、由于對照品相對比較貴重，一般實驗室都會保存一段時間。如果下次分析時沒有回至室溫，或此時室溫與對照品溶液配制時的溫度已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化，都會造成分析結(jié)果的誤差。

h、有些人配好樣品后，喜歡用手去握著容量瓶，細心觀察的就會發(fā)現(xiàn)一會之后液面就明顯高于刻度。如果操作者沒有注意這點，有的樣品立即進樣，有的排隊過了一會再進樣，就會造成誤差。