瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量

一．原理

帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。其中，凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，使它成為分離、鑒定和提純核酸的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。與蛋白質(zhì)分子類似，核酸分子也是兩性解離分子。在pH3.5時(shí)，堿基上的氨基基團(tuán)解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有第一個(gè)磷酸解離，整個(gè)分子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；在pH值為8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動(dòng)時(shí)，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。所以采用適應(yīng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使不同分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的。

1）影響泳動(dòng)的四大因素：
① 影響泳動(dòng)的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動(dòng)速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物的摩擦力越大，泳動(dòng)速率越小。即泳動(dòng)率與顆粒的分子大小、介質(zhì)粘度成反比；與顆粒所帶電荷成正比。

② 支持物介質(zhì)：DNA的凝膠電泳常使用兩種支持材料：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片斷。瓊脂糖的孔徑大，可以分離長(zhǎng)度為100bp至60kb的核酸片斷；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（5-50bp）的核酸。

③ 電場(chǎng)強(qiáng)度：電泳場(chǎng)兩極間單位支持物長(zhǎng)度的電壓降即為電場(chǎng)強(qiáng)度或電壓梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的泳動(dòng)率愈快，但凝膠的有效分離范圍隨電壓的增大而減小。在低電壓時(shí)，線性DNA分子的泳動(dòng)率與電壓成正比。一般凝膠電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度不超過5V/cm。

④ 緩沖液離子強(qiáng)度：緩沖液是電泳場(chǎng)中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。Tris·Cl緩沖體系中，由于Cl-的泳動(dòng)速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現(xiàn)象，所以常用TAE、TBE、TPE三種緩沖體系。緩沖液的pH值直接影響DNA解離程度和電荷密度，緩沖液pH值與核酸樣品的等電點(diǎn)相距越遠(yuǎn)，樣品所攜帶電荷量越多，泳動(dòng)速度越快。核酸電泳緩沖液，常采用偏堿性或中性條件，使核酸分子帶負(fù)電荷，向正極泳動(dòng)。緩沖液的離子強(qiáng)度與樣品泳動(dòng)速度呈反比，電泳的最適離子強(qiáng)度一般在0.02-0.2之間。

2）指示劑
電泳過程中，常使用一種由顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。核酸電泳常用的指示劑有兩種：溴酚蘭——成藍(lán)紫色；二甲苯青——成藍(lán)色。溴酚蘭的分子量為670Da，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同，它的分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，故普遍用作指示劑。二甲苯青的分子量為554.6Da，攜帶的電荷量比溴酚蘭少，在凝膠中遷移率比溴酚蘭慢，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，也有溴酚蘭和二甲苯青混合應(yīng)用。指示劑一般加在上樣緩沖液中，為了使樣品能沉入膠孔，還要加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。

3）染色劑
核酸經(jīng)過染色才能顯示帶型，最常用的是溴化乙錠染色法。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。激發(fā)熒光的能量來源于兩個(gè)方面，一是核酸吸收波長(zhǎng)為260nm的紫外線后能將能量傳送給溴化乙錠，二是結(jié)合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波長(zhǎng)為300nm和360nm的紫外線的能量，來源于這兩方面的能量，最終激發(fā)EB發(fā)射出波長(zhǎng)為590nm的可見光譜紅橙區(qū)的紅色熒光。EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠中的EB本身發(fā)出的熒光強(qiáng)大10倍，因此不需要洗凈背景就能清楚地觀察到核酸的電泳帶型。通常，在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB，可以在電泳過程中隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，這種方法使用于一般性的核酸檢測(cè)。
由于EB見光易分解，故應(yīng)存棕色瓶中于4℃條件下保存。單鏈DNA、RNA分子常存在自身配對(duì)的雙鏈區(qū)，也可以嵌入EB分子，但嵌入量少，因而，熒光較低，其最低檢測(cè)量為 0.1μg。

二．材料與方法

1 材料
RNA樣品

2 儀器、用具
電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、微波爐、移液器等

3 試劑
(1) 1×TAE 電泳緩沖液
(2) 溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心操作]
(3) 瓊脂糖
(4) 6×加樣緩沖液

4 方法
(1) 選擇孔徑大小適合的點(diǎn)樣梳，垂直架在膠版的一端，使點(diǎn)樣梳底部離電泳槽水平面的距離為0.5-1mm。
(2) 稱取0.25g瓊脂糖，加入25ml 1×TAE電泳緩沖液中，微波爐加熱使瓊脂糖溶解均勻。
(3) 于50ml的離心管中加入1.25μl EB (10mg/ml)。
(4) 待凝膠冷卻至50℃左右，將凝膠倒入50ml離心管中。
(5) 將離心管中的凝膠溶液輕輕倒入電泳凝膠板上，除去氣泡。
(6) 待凝膠凝固后，小心取出點(diǎn)樣梳。
(7) 在電泳槽中加入1×TAE 電泳緩沖液，將膠板放入電泳槽中（點(diǎn)樣孔一端靠近電泳槽的負(fù)極），使電泳緩沖液沒過膠面。
(8) 待測(cè)樣品中加入1/6體積的6×上樣緩沖液，混合后，移液槍點(diǎn)樣，記錄樣品點(diǎn)樣順序及樣量。
(9) 連接電泳槽與電泳儀之間的電源線，正極為紅色，負(fù)極為黑色。
(10) 開啟電源，開始電泳，最高電壓不超過5V/cm。
(11) 當(dāng)指示劑跑過膠板的2/3，可終止電泳；切斷電源后，將電泳凝膠塊放在凝膠成像儀中觀察，拍照。