細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)和樣本制備操作

一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解，具體方法如下：

試劑與設(shè)備
（1）表達(dá)待檢測(cè)蛋白質(zhì)的細(xì)菌。
（2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
（3）2xSDS凝膠加樣緩沖液：
100mmol／L Tris—HCl（pH6.8）
200mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）
4％ SDS（電泳級(jí)）
0.2％ 溴酚藍(lán)
20％ 甘油
不含有二硫蘇糖醇（DTT）的2XSDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前須從1mol／L二硫蘇糖醇儲(chǔ)存液現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。
（4）臺(tái)式離心機(jī)。
（5）超聲破碎儀。
（6）水浴箱。
（7）渦漩振蕩器。
（8）加樣器與吸頭等。

操作步驟
（1）表達(dá)靶蛋白大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后，用微量離心機(jī)以12 000g離心30s，收集1ml培養(yǎng)的菌體。
（2）吸取培養(yǎng)液，加入0.5ml用冰預(yù)冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振蕩沉淀的菌體，使之復(fù)懸，用微量離心機(jī)于0°C以12000g離心30s回收菌體。
（3）再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。
（4）加入25μl水，振蕩使沉淀復(fù)懸，一旦菌體分散開來，立即加入25μl 2XSDS凝膠加樣緩沖液，繼續(xù)振蕩20s。
（5）樣品在沸水浴中放置5min。
（6）采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時(shí)處理多個(gè)樣品的超聲處理儀對(duì)DNA進(jìn)行剪切，根據(jù)所用超聲處理儀的輸出功率及其設(shè)定狀態(tài)，以最大功率處理0.5—2min應(yīng)能有效地將裂解液粘度降至可控水平；
（7）樣品于室溫以12000g離心10min，將上清液移至另一管中，棄沉淀物；
（8）吸取經(jīng)剪切或超聲處理的樣品25μl電泳，剩余樣品保存于—20℃?zhèn)溆谩?/div>

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