慢病毒感染后熒光表達(dá)較弱的原因

熒光蛋白的亮度與啟動(dòng)子、表達(dá)方式和連接原件等有關(guān)，不同啟動(dòng)子誘導(dǎo)熒光蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱不同，如UBC相對(duì)于EF1α、CAG、CMV等強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)較弱。

融合或非融合表達(dá)與熒光強(qiáng)度也有很大關(guān)系，融合表達(dá)時(shí)熒光蛋白可能出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊等現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測(cè)不到熒光信號(hào)或熒光較弱。非融合表達(dá)時(shí)一般選擇連接肽作為連接原件，如2A肽或IRES將ORF分隔開(kāi)；選擇IRES，下游ORF的表達(dá)明顯弱于上游，2A肽可以避免上下游ORF表達(dá)強(qiáng)弱不一致的問(wèn)題，因此更為常用，如P2A和T2A不過(guò)2A肽切割后容易有殘留氨基酸。

帶熒光的慢病毒感染細(xì)胞后，熒光的強(qiáng)度取決于病毒進(jìn)入到細(xì)胞的顆粒數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞類型、觀察時(shí)間等因素，熒光表達(dá)的強(qiáng)度與目的細(xì)胞感染病毒的顆粒數(shù)正相關(guān)，一般感染細(xì)胞后72h觀察熒光強(qiáng)度最佳，而增殖較慢的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

也可能會(huì)遇到過(guò)表達(dá)的慢病毒比對(duì)照的熒光要暗的情況，這主要是因?yàn)榛虻牟迦?，?huì)影響位于下游的熒光蛋白表達(dá)，對(duì)照或干擾的病毒由于沒(méi)有插入或插入序列非常短熒光不受影響，而插入基因后，尤其是較長(zhǎng)片段和高GC片段，則會(huì)降低熒光強(qiáng)度。