穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建與傳代步驟

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建方法：
慢病毒載體包裝慢病毒后感染Hela細(xì)胞，用嘌呤霉索篩選得到EGFP過表達(dá)多克隆細(xì)胞株。收到細(xì)胞的處理：根據(jù)客戶所在地及發(fā)貨季節(jié)，我們可能采用干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞或者常溫運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)瓶細(xì)胞兩種不同形式發(fā)貨。收到細(xì)胞后根據(jù)細(xì)胞運(yùn)輸類型采用下面兩種方式操作。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株傳代方式:
1、傳代前將細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶溫浴到37C。
2、吸去細(xì)胞培養(yǎng)液。用PBS漂洗--次。
3、加入適量胰蛋白酶，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶，使胰蛋白酶均勻覆蓋細(xì)胞。吸去胰蛋白酶，將培養(yǎng)瓶放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37攝氏度消化。在倒置顯微鏡下觀察，看到細(xì)胞分開及稍微變圓即可，過度消化可能導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難。
4、加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)基，用吸管輕柔吹打分散細(xì)胞。按1:3到1:5接種細(xì)胞。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株凍存方法;
1、將細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶和凍存液溫浴到37C。
2、凍存的細(xì)胞應(yīng)為狀態(tài)好，生長旺盛的細(xì)胞。按細(xì)胞傳代方法消化細(xì)胞，用適量細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，重懸細(xì)胞。
3、室溫200g離心10分鐘收集細(xì)胞，用凍存液重懸細(xì)胞，并調(diào)節(jié)濃度至大約1X10^6個(gè)細(xì)胞/ml。分裝到細(xì)胞凍存管。
4、將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒，-80C過夜。將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。