單抗的標(biāo)記技術(shù)詳細(xì)介紹

目前動(dòng)物用單抗，在動(dòng)物疫病診斷和檢疫、妊娠檢測、性別鑒定等方面有廣泛的應(yīng)用，大多以診斷試劑(盒)的形式提供，其中核心試劑為標(biāo)記的單抗。下面遠(yuǎn)慕將介紹最常用的幾種標(biāo)記技術(shù)。 1．酶標(biāo)記
(1)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基
與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。
這里介紹兩種程序。
程序一：
①將5mg HRP溶于0．5mL 0．1mol／L NaHCO3溶液中；加0．5mL 10mmol／L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2h。
②加0．75mL 0．1mol／L Na2CO3混勻。
③加入0．75mL小鼠已處理的腹水，或純化單抗等(15mg／mL)，混勻。
④稱取Sephadex G25干粉0．3g，加入一支下口墊玻璃棉的5mL注射器外簡內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用(避光)3h或4℃過夜。
⑤用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1／20體積新鮮配制的5mg／mL NaBH4溶液，混勻，室溫作用30min；再加入3／20體積NaBH4溶液，混勻，室溫作用1h(或4℃過夜)。
⑥將交聯(lián)物過Sephadex G200或Sepharose 6B(2．6cm×50cm)層析純化，分管收集第一峰。
⑦酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：
克分子比值測定
酶量(mg／mL)=OD403×0．4
IgG量(mg／mL)=(OD280—OD403×0．3)×0.62
克分子比值(E／P)=酶量×4／IgG量，一般在1～2
酶結(jié)合率=酶量×體積／抗體
標(biāo)記率一般為0．3～0．6，即1～2個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上，標(biāo)記率可大于0．6，0．8，0．9；OD403／OD280等于0．4時(shí)，E／P約為1。
標(biāo)記率=OD403／OD280
酶活性和抗體活性的測定可應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、DAB—H2O2顯色反應(yīng)測定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價(jià)、特異性。
⑧HlRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝一20℃存放，防止反復(fù)凍融；或加入等量60％甘油4℃保存；不宜加。NaN3或酚防腐，否則會(huì)影響酶活性。必要時(shí)凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。

程序二；
①將5mg HRP溶于0．3mol／L  pH8．1 NaHCO3溶液中，加入1％二硝基氟苯無水乙醇溶液0．1mL，室溫?cái)嚢枳饔?h，以封閉HRP分子上的a和ε氨基。
②再加1mL 0．06mo1／L過碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30min，溶液呈黃綠色；隨后加1mL 0．06mol／L乙二醇，輕攪1h，中止氧化反應(yīng)。
③移入透析袋中，在1000mL 0．01moI／L pH9．5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過夜，更換三次緩沖液，注意避光。
④吸取上述醛化好的HRP溶液3mL，加入5mgIgG的碳酸鹽緩沖液1mL，室溫輕攪2～3h，避光；加入5mgNaBH4，4℃放置3h或過夜，或換用乙醇胺(2mol／L  pH9．5)0．2mL，作用7h。
⑤再移入透析袋中，在0．02mol／L  pH7．4  PBS中透析24h，更換3次緩沖液。
⑥用3000r／min離心30min，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析3次，沉淀用少許PBS溶解，透析或?qū)游龀}，必要時(shí)進(jìn)一步層析純化。
其余步驟同程序一⑦⑧。

(2)堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記堿性磷酸酶(AP)用于標(biāo)記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個(gè)醛基結(jié)合，制備成締合物。該法簡便，但所得產(chǎn)物不均一，抗體活性損失大，酶標(biāo)記率低。其程序如下：
①將5mgAP加入1mL抗體溶液(2mg／mL)中溶解，裝入透析袋，于4℃對(duì)0．01mol／L  pH7．2PBS透析18h，換液3次。
②加入2．5%戊二醛20μL，室溫作用1～2h，4℃對(duì)PBS透析過夜，其間換液3次。
③換用0．05mol／L  pH8．0 Tri-PHCl緩沖液透析，4℃過夜，換液3次。
④取出標(biāo)記抗體，用含1％ BSA的 Tris—HCl緩沖液稀釋至4mL，即為AP標(biāo)記物原液。
⑤每毫升中加入0．4mL甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩?br>
(3)PAP、APAAP的制備PAP(過氧化物酶～抗過氧化物酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù))、APAAP(堿性磷酸酶一抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù))的制備對(duì)于日益廣泛使用單抗的免疫細(xì)胞化學(xué)有重要意義?，F(xiàn)在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應(yīng)，只要配以相應(yīng)的橋抗體，即可非常便利地應(yīng)用單抗。因?yàn)镻AP法和APAAP法不用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，它們的活性均不受化學(xué)因素的影響，提高了敏感性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得免疫沉淀物，再加入酶鹽水．過量的酶有助于免疫沉淀物的解離反應(yīng)，調(diào)pH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAE。艱據(jù)需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應(yīng)橋抗體結(jié)合后，再與特定單抗組成完整的診斷試劑，這樣，單抗即可一步法用于診斷或檢測試驗(yàn)等。

2．熒光素標(biāo)記
(1)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記FITC標(biāo)記抗體的原理是在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰基能與IgG的自由氨基結(jié)合，形成IgG與熒光素的結(jié)合物。FITC是最常用的熒光素，其次選用TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)。FITC和TRITC是常用的雙標(biāo)記組合。其標(biāo)記步驟如下：
①以碳酸鹽緩沖液(pH9．3，Na2CO3  8．6g，NaHCO3 17．3g，蒸餾水1000mL)凋整抗體濃度至10mg／mL。
②取5mL抗體溶液置于10mL小燒杯中。
③稱取1mg FITC溶于0．2mL  DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內(nèi)，邊加邊輕攪；其后室溫避光作用2h。
④將交聯(lián)物經(jīng)SephadexG25或G50柱層析除去游離的熒光素；分管收集第一峰為標(biāo)記的抗體。
⑤FITC的結(jié)合物質(zhì)量鑒定
IgG量(mg／mL)=(OD280—OD495×0．35)／1．4
F／P=2．87×OD495／(OD280一OD495×0.35)
一般來說，F(xiàn)ITC對(duì)抗體的摩爾比為3；1時(shí)適合于組織切片染色，為(5~6)：1時(shí)適合于細(xì)胞懸液染色。以標(biāo)記抗體染色各種抗原，測定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。
⑥標(biāo)記抗體的保存：宣保存于4℃，加NaN3防腐。
(2)異硫氰酸羅丹明(TRITC)標(biāo)記基本與FITC標(biāo)記相同。

3．同位素標(biāo)記
必須強(qiáng)調(diào)的是在使用同位素標(biāo)記單抗或其他蛋白之前，應(yīng)掌握同位素操作和防護(hù)知識(shí)。
正常情況下應(yīng)包括避免物理的接觸和對(duì)r-射線照射的有效保護(hù)，操作和使用同位素標(biāo)記抗體時(shí)，應(yīng)利用防護(hù)裝置，并合理處置含放射性的廢料。
(1)碘標(biāo)記用碘標(biāo)記抗體是一種有效的標(biāo)記方法。l25I衰變產(chǎn)生低能的γ和X射線，很容易被檢測出來，而其60d的半衰期保證足夠的有效使用期，且能很方便地處理放射廢料。
最常用的碘標(biāo)記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉(zhuǎn)化成I2，游離、I2可與抗體分子中酪氨酸和一些組氨酸發(fā)生鹵化反應(yīng)，用還原劑和游離酪氨酸終止反應(yīng)，經(jīng)凝膠過濾將標(biāo)記的抗體與碘化酪氨酸及還原劑分離開。其主要操作步驟如下：
①在進(jìn)行標(biāo)記之前，先選用截流分子質(zhì)量為20000~50000的凝膠，制備1mL凝膠柱，然后分別用10倍體積的1％BSA／PBS／0．02％疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。
②加入10μg純化單抗至含有25μL  2．5mol／L磷酸鈉(pH7．5)的1．5mL指形管內(nèi)。隨后，加入500μCi Na125I混勻。
③加入25μL新配制的2mg／mL氯胺T。室溫放置60s。再加入50μL氯胺T終止液(含2．4mg／mL偏重亞硫酸鈉，10mg／mL酪氨酸，10％甘油和0．1％環(huán)乙烷酰二甲苯的PBS)。
④將上述碘標(biāo)記物上樣在凝膠柱表面，小心放開柱體下口，用1．5mL指形管收集。當(dāng)?shù)鈽?biāo)記物全部進(jìn)入柱體，加入0．3mL含0．03％疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0．3mL，然后再加0．3mL 0．03％  NaN3 PBS，下口收集0．3mL，重復(fù)進(jìn)行，同時(shí)用同位素檢測儀測定標(biāo)記與未標(biāo)記的單抗。標(biāo)記抗體在第二至第四管出現(xiàn)。無害化處理柱子和非單抗標(biāo)記部分。
⑤將標(biāo)記單抗保存于4℃可使用6周。

(2)生物合成法標(biāo)記將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含有放射性前體的培養(yǎng)基中，隨著抗體分子的合成、組裝，同位索會(huì)標(biāo)記在抗體分子的初級(jí)氨基酸鏈上，本方法不會(huì)導(dǎo)致抗體活性的喪失。
其主要步驟是：
①離心收集處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，需2×106個(gè)細(xì)胞。以預(yù)熱37℃不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基洗滌上述細(xì)胞。
②用含2％PBS不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基懸浮雜交瘤細(xì)胞至106個(gè)／mL，加入35S甲硫氨酸(每次加入100μ Ci可產(chǎn)生105～106cpm的抗體)。
③經(jīng)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，離心后，吸出培養(yǎng)上清液，分別加入1／20體積的1mol／L Tris(pH8．0)及疊氮鈉至濃度0．02％。該標(biāo)記抗體可按純化單抗方法進(jìn)行。

4．生物素標(biāo)記
生物索標(biāo)記反應(yīng)常用生物索琥珀酰亞胺酯進(jìn)行。生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而完成標(biāo)記。其主要步驟是：
(1)用二甲基亞砜配制10mg／mL的N羥琥珀酰亞胺生物素(應(yīng)根據(jù)需要選用不同大小和間臂長的生物索化琥珀酰酯)。
(2)用硼酸鈉緩沖液(0．1mol／L，pH8．0)稀釋單抗溶液至1～3mg／mL。
(3)每毫克抗體加入25～250μg的生物索酯，混勻后，室溫作用4h。
(4)按每250μg生物素酯加入20μL  1mol／LNH4Cl終止反應(yīng)，室溫放置10min。
(5)以PBS充分透析除去游離生物素，標(biāo)記抗體凍存。

5．其他標(biāo)記技術(shù)
適用于蛋白質(zhì)的其他標(biāo)記方法也可用于單抗，如膠體金標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、SPA標(biāo)記、鐵蛋白標(biāo)記等