糖類檢測方法，科研人必看！

對于糖的測定方法有很多，大致可分為三類
1.物理法，（1.旋光法,  2 .折光法,  3.比重法,）
2.物理化學法,(1.點位法, 2極普法, 3.光度法, 4.色譜法)
3.化學方法,(1.斐林氏法. 2.高錳酸鉀法. 3.碘量法. 4.鐵氰化鉀法. 5.蒽銅比色法. 6.咔唑比色法)
共計三大種，在測定其他碳水化合物時，往往是使其水解為糖再進行測定。

一.總糖的測定
食品中的總糖主要指具有還原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在測定條件下能水解為
還原性的單糖的蔗糖（水解后為1分子葡萄糖和1分子果糖），麥芽糖（水解后為2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后為2分子葡萄糖）。還原糖類之所以具有還原性是由于分子中含有游離的醛基（-CHO）或酮基(=C=O)。
測定總糖的經(jīng)典化學方法都是以其能被各種試劑氧化為基礎的。這些方法中，以各種根據(jù)斐林氏溶液的氧化作用的改進法的應用范圍最廣。在這里我們主要給大家介紹鐵氰化鉀法，蒽銅比色法，斐林氏容量法。斐林氏容量法由于反應復雜，影響因素較多，所以不如鐵氰化鉀法準確，但其操作簡單迅速，試劑穩(wěn)定，故被廣泛采用。蒽銅比色法要求比色時糖液濃度在一定范圍內(nèi)，但要求檢測液澄清，此外，在大多數(shù)情況下，測定要求不包括淀粉和糊精，這就要在測定前將淀粉，糊精去掉，這樣就使操作復雜化，限制了其廣泛應用。

（一）鐵氰化鉀法
1.原理：樣品中原有的和水解后產(chǎn)生的轉化糖都具有還原性質(zhì)，在堿性溶液中能將鐵氰化鉀還原，根據(jù)鐵氰化鉀的
濃度和檢驗滴定量可計算出含糖量。其反應為下：
C6H12O6+6K3[Fe(CN)6] + 6KOH→(CHOH)4·(COOH)2+ 6K4［Fe(CN)6］+ 4H2O
滴定終了時，稍過量的轉化糖即將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體。

2，試劑
1）1％的次甲基蘭指示劑
2)鹽酸（水解作用）
3）10％和30％的NaOH溶液
4）1％鐵氰化鉀（貯存特色瓶，臨用前標定）

標定步驟
稱蔗糖1.0000g→定容500ml→取此液50ml→于100ml容量瓶→加hcl5ml→搖勻→65-70℃水裕15分鐘→取出冷卻→用30％NaOH中和→加水于刻度→倒入滴定管中→取10ml1％鐵氰化鉀于錐形瓶中→加10％NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠顆粒→加熱至沸→保持一分鐘→加次甲基蘭1滴→立即以糖液滴足至藍色退去為止，記錄用量。
正式滴定比較滴定時少0.5ml糖液，煮沸1分鐘，加指示劑一滴，再用糖液滴定至蘭色褪去，計算鐵氰化鉀溶液的濃度。
A=(W·V)/(1000×0.95)
A：相當于10ml鐵氰化鉀溶液的轉化糖的量（克）
V：滴定時消耗的糖液的體積
W：稱取純蔗糖的量
1000：稀釋比
0.95：換算等數(shù)

3．操作方法
稀釋10g→用100ml水作溶液→于250ml容量瓶→加20％醋酸鉛10ml→至沉淀完為止→加10ml10％NA2HPO4→至不在產(chǎn)生沉淀為止→加水至刻度→過濾－取濾液50ml→于100ml容量瓶中→按鐵氰化鉀標定法進行轉化，中和及滴定

計算糖含量
總糖（以轉化糖計%）= (A×1000)/(W·V)×100
A：相當于10ml鐵氰化鉀溶液的轉化糖的重量，
W：樣品的重量
V：滴定時樣液消耗的體積

4．實驗應注意
（a）達終點時，過量的轉化糖將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體，隱色體容量受空氣中氧所氧化，很快又變
成指示劑的顏色。
（b）整個過程應在低溫電爐上進行，滴定要速度，否則終點不明顯
（c）糖與硫酸反應脫水生成羥甲基呋喃甲醛，生產(chǎn)物再與蒽銅縮合成蘭色化合物，其顏色深淺與溶液中糖的濃度
成正比，單、雙糖等糖類都直接于試劑發(fā)生作用，因此不需要水解。

（二）蒽銅的比色法
1.原理：糖與硫酸反應脫水生成羥甲基呋喃甲醛，生產(chǎn)物再與蒽銅縮合成蘭色化合物，其顏色深淺與溶液中糖的濃
度成正比，可比色定量。

2.試劑
（1）硫酸鋅溶液：溶解500g化學純硫酸鋅于500ml水中
（2）亞鐵氰化鉀溶液：溶解10.6g化學純亞鐵氰化鉀于100ml水中
（3）0.2％蒽銅試劑：溶解蒽銅0.2g于100ml95％硫酸中，置棕色瓶中冷暗處保存
（4）0.1％葡萄糖液：準確稱干燥葡萄糖0.1000g定容100ml

3.操作方法
（1）標準曲線繪制
（2）100ml容量瓶編號
沸水浴加熱6分鐘，取出冷卻→用1cm比色杯→610nm測定吸光度→作出以吸光度為橫坐標，糖液濃度為縱坐標的準
曲線
（3）樣品測定
稱10g樣品→于100ml熱水加入500ml容量瓶中－加硫酸鋅5ml→沸水浴5分鐘→取出再搖動下加亞鐵氰化鉀5ml，→冷卻→定容500ml→過濾→吸濾液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀釋液1ml，于比色管中→加10ml蒽銅試劑→搖勻→水浴加熱6分鐘→冷卻→比色

試驗注意
1，樣液必須清澈透明，加熱后不應有蛋白質(zhì)沉淀
2，樣品顏色較深時，可用活性炭脫色后再進行測定
3，此法與所用的硫酸濃度和加熱時間有關
4，所取糖液濃度在1-2.5mg/100ml之間

二.還原糖的測定方法
還原糖包括葡萄糖、果糖、麥芽糖，在葡萄糖分子中含有淤青的醛莖，在果糖分子中含有淤青的酮莖，在乳糖中和
麥芽糖中含有淤青的半縮羧莖，因此都有還原性。在測定還原糖時一般測定總糖時所有將糖類水解為轉化糖再測定
的方法都可用來測定還原糖。

（一）斐林氏容量法
1.此法的原理、試劑、方法與總糖的測定方法相同。只是樣品溶液不必以過轉化，而是直接取濾液進行滴定，濾液進行滴定，濾液中的還原糖含量以在0.2-0.5%為好，又能通過增減樣品量或改變稀釋倍數(shù)來調(diào)節(jié)。10毫升費林氏A、B液混合時理論上相當還原糖量如下：
葡萄糖（無水）果糖或轉化糖尿病  0.0500克
乳糖尿病                        0.0678克
麥芽糖                          0.0807克

2試劑
（1）斐林氏A液，稱69.8g cp硫酸銅于100ml水中，過濾備用
（2）斐林氏B液，稱34.6g.cp濃流鋅鈉和100gcp NaOH于1000ml水中，過濾備用

3方法
稱取樣品10-20g：制備與轉化同鐵氰化鉀法。將樣液倒入滴管中，吸取A,B液準備預滴定

預滴定：
吸A、B液各5ml→從滴管中加15ml樣液→加熱至沸→繼續(xù)滴加樣液→至蘭色變潛→加3滴次甲基蘭→在1分鐘內(nèi)滴定到終點
達到終點時，稍微過量的轉化糖，將蘭色的次甲基蘭染色體還原為無色的隱色體，而顯出氧化亞銅的紅色，去堿性條件下加熱糖的產(chǎn)物是復雜的。
去堿性中斷裂是由于堿度不同，加熱時間不同，生產(chǎn)不等的碎片，這種碎片給后面滴定帶來誤差，而且，這種碎片與糖沒有化合量的關系，所以，Lanecrol-Eynon Method作出數(shù)據(jù)檢索表

正式滴定：
吸A,B液各5ml→于三角瓶→加比預定量少0.5-1.0ml樣液→2分鐘內(nèi)要求沸騰1分鐘→加3滴指示劑→用樣液滴定蘭色消失
總沸騰時間為3分鐘，即滴定在3分鐘完成。

計算：
還原糖＝( F·V2)/(W·V1)×100
F：轉還糖回數(shù)，即與10ml斐林氏試液相當?shù)霓D化糖毫克數(shù)，
V1：樣品試液總體積
V2：樣品試液滴定量
W：樣品重量
在測量乳糖制品時，若蔗糖與乳糖的含量比超過3：1時，則應與滴定量中加上相關表中（課本中表9-8）校正值后在進行計算

我們舉例如下：
如果標準果糖溶液度為每100ml溶液含糖262.5mg。對于10ml斐林試液從9-5可以查得果糖液滴定應為20ml。如果不是20ml，可先算出A,B液校正等數(shù)。然后進行計算