膠原酶和胰酶在細胞原代培養(yǎng)中的區(qū)別

膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。消化原代培養(yǎng)的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振蕩,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.

酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為 0.1%-0.25%（活力 1:200 或 1:250），但遇到難消化的組織時，濃度可適當提高，消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進細胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

溫度 一般認為胰蛋白酶在 56℃時活性最強，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為 37℃，通常在 37℃進行消化比室溫作用快。

pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細胞也容易被消化下來，消化分離細胞時 PH 只能選用 7.6~8.0 之間，否則對細胞有損傷。

無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制時應(yīng)采用無鈣鎂離子的 PBS 配制。

消化時間 如果細胞消化時間過長，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般消化時間為 20 分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于 4℃過夜也可。

分離方法如下：

①過夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右，用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織，再加入 0.25% 的胰蛋白酶，搖勻后放 4℃過夜，次日再用 Hanks 液洗滌，棄去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細胞計數(shù)，按適當?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：

熱消化多次提取 -- 將剪碎的細胞塊加入 0.25% 胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作，再消化提取細胞。

冷消化多次提取 -- 方法同上，只是消化溫度為 4℃。

先熱消化后冷消化 -- 將組織塊先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于 4℃下過夜，次日再提取細胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。

?膠原酶（Collagenase）消化法

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率，最終濃度 200u/mL 或 0.1~0.3mg/mL. 此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。

經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未被完全消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此不必要再進一步消化處理。

非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一種非酶消化物，又稱螯合劑或 Versene, 全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 PBS 配成 0.02% 的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1 或 2:1），不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分離法的操作步驟：

（1）剪切 把組織塊剪碎，呈 1~5mm3?大小的組織塊。

（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂 PBS 洗 2-3 次（采用傾斜，自然沉降法）。

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA）于 37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖 1~2 次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。

（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培養(yǎng)基。

（6）機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網(wǎng)或 3~4 層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。

注意事項如下：

（1）組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。

原代細胞的培養(yǎng)方法

原代細胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細胞在體外進行的首次培養(yǎng)，是建立細胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細胞因剛從組織中分離開，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也最接近和反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。

原代細胞往往有多種細胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差異也照樣存在，原代細胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴格的對比性實驗研究，還需進行短期傳代培養(yǎng)。

1、組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長，方法簡便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細胞在小塊貼壁 24 小時后細胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5~7 天后組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實驗研究。

其培養(yǎng)方法如下：

（1）按照前述方法取材，將組織剪成或切成 1mm3?大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。

（2）將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距 0.2 cm~0.5cm，一般在 25mL 培養(yǎng)瓶（底面積為 17.5cm2）可接種 20~30 小塊為宜，小塊放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在 37℃溫箱內(nèi)。

（3）培養(yǎng) 2~4 小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng) 24 小時后再補液，培養(yǎng)初期移動和觀察時要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng) 3~5 天時可換液，一方面補充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。

原代細胞培養(yǎng) -2

2、消化培養(yǎng)法

該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細胞生長的細胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細胞分散形成細胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。

某些特殊類型細胞，如內(nèi)皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。

3、懸浮細胞培養(yǎng)法

對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

4、器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對器官組織的生長變化進行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。

1、器官培養(yǎng)的特殊的要求

（1）需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng)，其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養(yǎng)時為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過 1mm.

（2）器官內(nèi)部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：

a. 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。

b. 提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時仍需保持 5% CO2, 以維持 pH.

2、器官培養(yǎng)的方法

（1）將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為 1/2 皿高，使其表面鋪上 0.5mm 孔徑的濾膜。

（2）將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。

（3）將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過 200μm, 水平面積不超過 10mm2, 如為肝、腎不能大于 1mm2.

（4）將培養(yǎng)物置于 CO2?培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達 90%, 培養(yǎng)時注意使液面與膜保持在一致的水平上。

（5）上述器官培養(yǎng) 1~3 周（每隔 2~3 天換液一次）后可用于實驗和檢測。