對DNA分子做酶切時(shí)的注意事項(xiàng)

如果是要做酶切，提質(zhì)粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因?yàn)門E里面的離子會影響酶切的效率。

雙酶切制備克隆插入片段的載體，最好選擇帶有外源片段的質(zhì)粒，是否酶切完全，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷?？召|(zhì)粒單切完全和雙切完全在分子量上差異不大。

在做酶切時(shí)，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：

（1）各反應(yīng)成分均一；

（2）可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用；

（3）節(jié)省時(shí)間。 連接酶的常見種類和作用機(jī)制

1、T4DNA連接酶

T4DNA連接酶是目前應(yīng)用比較多的病毒基因組編碼的DNA連接酶，在基因重組中廣泛使用。噬菌體類型較多，目前研究發(fā)現(xiàn)T4噬菌體能夠合成T4DNA連接酶，并且已經(jīng)能夠從被T4嗜菌體感染的大腸桿菌中提取該酶，此外科學(xué)家也已經(jīng)定位該酶的合成基因，即噬菌體T4的30基因。T4DNA連接酶具有連接黏性末端和平末端的作用，研究人員總結(jié)DNA片段的連接過程，認(rèn)為整個(gè)DNA連接反應(yīng)可以通過三個(gè)連續(xù)步驟來完成：

（1）ATP通過斷裂最后一個(gè)高能磷酸鍵釋放能量，同時(shí)產(chǎn)生的AMP和T4DNA連接酶利用ATP水解釋放的能量形成E-AMP復(fù)合物；

（2）所形成的E-AMP復(fù)合物可以識別DNA雙鏈之前被切開的切口，識別之后AMP會脫離E-AMP復(fù)合物并與DNA的5’-P基團(tuán)結(jié)合；

（3）需要連接的另外一段DNA分子片段的3’-OH會攻擊第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基團(tuán)殘基發(fā)生反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出一個(gè)AMP。

2、 真核生物DNA連接酶

真核生物存在3種ATP依賴型DNA連接酶——DNA連接酶Ⅰ、DNA連接酶Ⅲ和DNA連接酶Ⅳ。研究顯示，DNA連接酶Ⅰ和DNA連接酶Ⅳ廣泛分布于真核生物中，如植物界和動物界，DNA連接酶Ⅲ則主要分布于脊椎動物中。

目前科學(xué)家認(rèn)為，在真核生物DNA復(fù)制過程中，起到連接作用的可能主要是DNA連接酶Ⅰ，DNA連接酶Ⅰ活性的調(diào)節(jié)與其氨基端有關(guān)，在其氨基端靠近活性中心有一個(gè)特定的部位，該部位可以通過磷酸化作用來調(diào)節(jié)DNA連接酶Ⅰ的活性。DNA連接酶Ⅰ的作用就是將DNA復(fù)制時(shí)復(fù)制叉處形成的不連續(xù)的后隨鏈（岡崎片段）連接起來。在此過程中DNA連接酶Ⅰ并不是單獨(dú)起作用，而是需要和多種蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA復(fù)制時(shí)，后隨鏈?zhǔn)怯蒁NA聚合酶α催化合成的，DNA聚合酶α先催化合成一段引物，然后依賴DNA聚合酶δ與增殖細(xì)胞核抗原（持續(xù)復(fù)制因子），從引物開始合成DNA，然后引物通過降解出去。此外，在損傷的DNA的堿基修復(fù)中，DNA連接酶Ⅰ也同樣起到重要的作用。首先細(xì)胞內(nèi)的特異性的核酸內(nèi)切酶和外切酶特異性識別損傷部位，在DNA單鏈損傷部位的附近進(jìn)行剪切，切除一段DNA，然后DNA聚合酶以另一條完整的DNA鏈作為模版進(jìn)行修復(fù)合成重新合成這段DNA，最后由DNA連接酶Ⅰ將缺口連接。