跑電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本技術(shù)。只要做分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn),可能或多或少,或早或晚都要跑跑電泳。
跑電泳的材料是瓊脂糖,瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)常用以DNA 切膠回收,DNA 分離和用于佐證DNA 是否重組、質(zhì)粒等是否切開。今天我們就來聊聊瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的一些小技巧小細(xì)節(jié)。
1 凝膠制作
1.1 凝膠濃度 配制凝膠的濃度據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變 ,一般在0.8% ~2.0%之間,如果一次配制凝膠100 ml,沒用完的凝膠可以再次融化,但隨著融化次數(shù)的增加,水分丟失也越多,凝膠濃度則會(huì)越來越高,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,補(bǔ)水辦法:一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度,煮膠后補(bǔ)充相應(yīng)的水分至原刻度;二是在煮膠前稱重,煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中,終濃度為0.5 t*g/ml;也可在電泳結(jié)束后染色。
1、2 梳板的選用 一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板,梳齒寬厚,形成的點(diǎn)樣孑L容積較大,用于DNA 片段回收實(shí)驗(yàn)等;相反,梳齒窄而薄,形成的點(diǎn)樣孑L容積就較小,用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定,一般來說,上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠,此時(shí)電泳條帶致密清晰,便于結(jié)果分析。另外,每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm,否則,拔梳板時(shí)易損壞凝膠孑L底層,導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然,點(diǎn)樣孑L的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān),一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板,應(yīng)急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右,拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中,然后垂直向上慢慢用力,因?yàn)橛幸后w的潤(rùn)滑作用,梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孑L。
2 點(diǎn)樣
點(diǎn)樣需加上樣緩沖液,因?yàn)樯蠘泳彌_液中加了甘油或蔗糖增加密度,使樣品沉入孑L底;指示樣品的遷移過程,上樣緩沖液中一般加了兩種指示劑,溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑并非染色劑,DNA染色劑是溴化乙錠,而且要在紫外光的激發(fā)下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6× (10×),表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液器基本垂直點(diǎn)樣孑L,用另一只手幫助固定移液器下端,移液器槍頭(Tip)jian端進(jìn)入點(diǎn)樣孑L即可將樣品注入孑L內(nèi),千萬不可將Tip尖插至孑L底,并點(diǎn)上適合的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),所謂適合是指樣品DNA分子量大小應(yīng)基本在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。
3 電泳
將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連,負(fù)極與負(fù)極相連,核酸帶負(fù)電荷,從負(fù)極向正極移動(dòng)。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同,電泳緩沖液剛好沒過凝膠1 mm 為好,電泳緩沖液太多則電流加大,凝膠發(fā)熱。電泳時(shí)凝膠上所加電壓一般不超過5 v/cm(指的是正負(fù)電極之間的距離,而不是凝膠的長(zhǎng)度),電泳時(shí)間一般為3O~60 min,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可作適當(dāng)調(diào)整,電壓增高,電泳時(shí)間縮短,核酸條帶相對(duì)來說不夠整齊,不夠清晰;相反,電壓降低,電泳時(shí)間較長(zhǎng),核酸條帶整齊清晰。另外,如果電泳后樣品泳動(dòng)很慢或者沒泳動(dòng),請(qǐng)檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。
4 結(jié)果分析
較成功的電泳結(jié)果是分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶整齊清晰,樣品條帶也整齊清晰,如果條帶模糊暗淡,單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說,可能的原因:溴化乙錠的質(zhì)和量怎樣?溴化乙錠見光易分解,母液配制時(shí)間過長(zhǎng)或保存不當(dāng)(一般4℃ 避光保存一年內(nèi)有效),或者終濃度沒達(dá)到0.5 vg/ml;電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過多,緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液,一般用2~3次就要更換,TBE緩沖液則可使用10次左右。
實(shí)際工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)小片段模糊不清,那足因?yàn)榄傊悄z濃度一般不會(huì)超過2 0% ,較小的核酸片段在它的分辨范圍之內(nèi),并且EB帶正電荷,電泳時(shí)會(huì)向負(fù)傲移動(dòng),如果將凝膠置含EB(0.5#g/m1)的水溶液中30 min,較小的片段則可重新染色:另外,溴化乙錠(EB)是一種中等強(qiáng)度誘變劑,操作過程中要戴手套,并將加有EB的染色液作好標(biāo)記、妥善保存。
除這些細(xì)節(jié)之外,還有一些注意事項(xiàng):
1. 酶切時(shí)所加的DNA 溶液體積不能太大,否則DNA 溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。
2. 酶活力通常用酶單位(U)表示,酶單位的定義是:在最適反應(yīng)條件下,1 小時(shí)完全降解1 mg λDNA 的酶量為一個(gè)單位,但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA 不象λDNA 那樣易于降解,需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的,除考慮成本外,酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
3. 市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大,為了省著點(diǎn)兒花,使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液進(jìn)行稀釋。另外,酶通常保存在50%的甘油中,實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在10%以下,否則,酶活性將受影響。
4. 觀察DNA 離不開紫外透射儀,可是紫外光對(duì)DNA 分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm),以減少紫外光切割DNA。
5. EB 是強(qiáng)誘變劑,還有中等毒性,就是有致癌性。配制和使用時(shí)都要戴好手套。盡量不要把EB 灑到桌面或地面上。如果真的不幸灑到桌面或地面上了,凡是沾污了EB 的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
6. 當(dāng)EB 放太多了,膠染色過深,DNA 帶看不清的時(shí)候,可將膠放入蒸餾水沖泡,30 分鐘后再觀察。
但有時(shí)候,跑電泳跑著跑著也會(huì)出現(xiàn)一些奇奇怪怪的現(xiàn)象。下面,就談一談跑電泳的過程中可能會(huì)發(fā)生的異?,F(xiàn)象,可能的原因,以及對(duì)策。