正確認(rèn)識支原體污染以及檢測與防治

一．什么是支原體污染

支原體是一種大小僅為0.2~0.3 um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）的原核生物，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題。當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。

二．支原體污染從哪來

細(xì)胞培養(yǎng)中有幾種支原體污染與人、牛和豬有關(guān)。實驗室的工作人員是口腔支原體、發(fā)酵支原體和人型支原體的主要來源。這三種支原體占細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的一半以上，它們主要存在于人的口咽部。精氨酸支原體和無膽甾原體是另兩類細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體，它們來自胎牛血清和新生牛血清。胰酶如果是豬來源的，那么也可能存在豬鼻支原體。

在超凈臺中，用胰蛋白酶消化該污染的細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，活的支原體可從細(xì)胞培養(yǎng)瓶外的細(xì)胞計數(shù)板、移液器、廢棄盤中被技術(shù)員分離出來。即使過了四至六天，活的支原體仍然可以存在于超凈臺表面，可被成功恢復(fù)。在超凈臺里，傳代完被支原體污染的細(xì)胞后，再傳代干凈的不含支原體的細(xì)胞，結(jié)果仍然在6周后被檢測出支原體陽性。這些結(jié)果表明，支原體的傳播是多么的快速和容易！它也警告我們，要最大限度的避免支原體的污染，因為一瓶細(xì)胞發(fā)生污染，就會帶來支原體傳播的可能。

不恰當(dāng)?shù)南緦?dǎo)致污染的另一個原因。高壓鍋或干熱烤箱中堆積太多的物品造成加熱不均，使一小部分耗材未得到消毒。滅菌循環(huán)時間過短是另一個消毒上犯的錯誤，特別是對于超過500ml的液體，或者是包含固體成分的溶液，或膠體物質(zhì)如瓊脂、淀粉等。為了實現(xiàn)無菌，滅菌材料的尺寸、質(zhì)量、性質(zhì)和體積必須始終考慮。

三．支原體污染怎么測

1.相差顯微境檢測：

將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察。支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間；

2.熒光染色法：

熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細(xì)胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點；

3.電鏡檢查：

用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡；

4.DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：

檢出率高。但方法較為復(fù)雜；

5.PCR檢測支原體污染：

PCR作為一種快速、靈敏、特異且簡便的基因診斷技術(shù)已應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病的診斷。根據(jù)支原體基因組內(nèi)的保守序列設(shè)計特異引物，對待檢樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術(shù)用于支原體污染的檢測，周期短、靈敏度高、特異性好、操作簡單且一次可檢測大量樣品。

四．支原體污染怎么防

1.收到新細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測，將支原體檢測陽性的細(xì)胞與其他細(xì)胞分開處理和培養(yǎng)；

2.在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，要保證環(huán)境的干凈，無菌。對生物安全柜，細(xì)胞培養(yǎng)箱定期消毒。實驗器材照紫外，用75%酒精擦拭。實驗耗材進(jìn)行高壓滅菌；

3.實驗過程中需要的培養(yǎng)基，血清在使用前進(jìn)行支原體檢測；

4.實驗室要定期打掃，每次使用細(xì)胞間要提前打開紫外線燈照射半小時以上。

五．支原體污染怎么治

對于非重要的細(xì)胞，如培養(yǎng)中的細(xì)胞、WCB的細(xì)胞等，將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細(xì)胞，如來源珍貴或?qū)嶒炇抑屑?xì)胞保藏量較小等可以采用以下的方法。

1.用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，作用濃度為 25μg/ml，兩周可以清除支原體。

2.用清洗純化法清除支原體污染的方法：細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌，其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限. 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。

3.藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。

4.使用支原體清除培養(yǎng)基，每2-3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，換液時用無菌的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞1-2次；期間如果細(xì)胞密度過大，請保持細(xì)胞密度適當(dāng)（貼壁細(xì)胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養(yǎng)器皿，3天之后，即可見明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測支原體是否殺滅完全；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細(xì)胞再次受到“支原體”的污染，以后每隔1個月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測，以保證沒有新的支原體污染。