大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞這樣操作！

根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的類型，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。

一、動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性及培養(yǎng)溫度

1.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2.細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3.需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌

4.群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）

5.培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高

6.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

依據(jù)在體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)依賴性差異，動(dòng)物細(xì)胞可分為兩類：

●貼壁依賴型細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長(zhǎng)，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類。

●非貼壁依賴型細(xì)胞：無(wú)需附著于固相表面即可生長(zhǎng)，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度相當(dāng)于各種細(xì)胞或組織取材機(jī)體的正常溫度。人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細(xì)胞正常的代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至死亡?？偟膩?lái)說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐力比高溫高。溫度不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比；細(xì)胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復(fù)；當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時(shí)，許多細(xì)胞將死亡。當(dāng)溫度下降到30~20℃時(shí)，細(xì)胞代謝降低，因而與培養(yǎng)基之間物質(zhì)交換減少。首先看到的是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及細(xì)胞從基質(zhì)上脫落下來(lái)。當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時(shí)，它們?cè)械男螒B(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平。 二、貼壁培養(yǎng)（attachment culture）是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。

1.生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

2.貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過(guò)濾系統(tǒng)。

●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。

●適用于所有類型細(xì)胞。

3.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)；

4.細(xì)胞貼壁的表面：要求具有凈陽(yáng)電荷和高度表面活性。對(duì)微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽(yáng)電荷。

5.貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。

●轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過(guò)渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡(jiǎn)單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點(diǎn)。但也有其缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受到限制等。現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩類。

●反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)：此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動(dòng)，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，故多用于制備用量較小、價(jià)值高的生物藥品。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器，用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)可用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤(pán)狀載體。此載體是直徑6毫米無(wú)紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細(xì)胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細(xì)胞培養(yǎng)使用最多方式，用于雜交瘤細(xì)胞、Hela細(xì)胞、293細(xì)胞、CHO細(xì)胞及其它細(xì)胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種后貼壁快。

三、懸浮培養(yǎng)（suspension culture）：是指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)通起來(lái)的。

無(wú)血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動(dòng)物來(lái)源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。

四、固定化培養(yǎng)（immobilization culture）：是將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來(lái)，再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易于產(chǎn)物分開(kāi)，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價(jià)貼附法、離子/共價(jià)交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。

1.吸附法:用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡(jiǎn)便、條件溫和、是動(dòng)物細(xì)胞固定化中最早研究使用的方法。缺點(diǎn)是：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門(mén)介紹。

2.共價(jià)貼附法:利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須引入化學(xué)試劑，對(duì)細(xì)胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。

3. 離子/共價(jià)交聯(lián)法:雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會(huì)在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞方法稱為離子/共價(jià)交聯(lián)法（cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會(huì)使一些細(xì)胞死亡，也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散限制。

4.包埋法:將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優(yōu)點(diǎn)是：步驟簡(jiǎn)便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞泄漏少，抗機(jī)械剪切。缺點(diǎn)是：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

5.微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應(yīng)注意：

●溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；

●所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害；

●膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)；

●膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

五、抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用

生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡中占主要部分。最近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細(xì)胞的死亡中80%是凋亡所導(dǎo)致,而不是以前所認(rèn)為的壞死。而在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的最大障礙。理論上講，防止或延長(zhǎng)細(xì)胞死亡，可以極大提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量。

細(xì)胞凋亡由一系列基因精確地調(diào)控，是多細(xì)胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識(shí)別一個(gè)4氨基酸序列，并在識(shí)別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識(shí)別的序列，可以切割活化自身而導(dǎo)致信號(hào)放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級(jí)聯(lián)放大，最終作用于效應(yīng)蛋白，引起細(xì)胞凋亡。

所以在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)干擾細(xì)胞在培養(yǎng)中凋亡的發(fā)生，提高細(xì)胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度、延長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)周期，從而提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量2-3倍。

1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡

在常規(guī)生物反應(yīng)器構(gòu)造中，營(yíng)養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長(zhǎng)因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)可抑制凋亡、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見(jiàn)的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。

2.基因抗凋亡

與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對(duì)其進(jìn)行正、負(fù)向的調(diào)控，因此可通過(guò)導(dǎo)入相應(yīng)基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凋亡活性。

3.化學(xué)方法抗凋亡

凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化如改變細(xì)胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號(hào)階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在絕大多數(shù)細(xì)胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止或至少延遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，運(yùn)用化學(xué)物質(zhì)可抑制信號(hào)效應(yīng)階段的發(fā)生，被認(rèn)為是抗調(diào)亡策略之一。