為啥你的PCR實(shí)驗(yàn)又雙叒叕失敗了？

首先，讓我們來(lái)回憶一下PCR鑒定的整個(gè)過(guò)程，主要包括樣本處理、配PCR體系、擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物電泳四個(gè)部分，接下來(lái)我們就從這幾個(gè)部分盤點(diǎn)PCR操作中的那些坑，請(qǐng)收下這份防坑指南。 1.樣本處理
PCR的第一個(gè)步驟就是處理樣本，這一步出問(wèn)題后面的也就廢了。取樣后，如果不能馬上處理樣本，短期放4℃保存，長(zhǎng)期放﹣20℃保存；此外，加完裂解液，要注意檢查樣本是否完全浸沒(méi)在裂解液中。

2.PCR體系
簡(jiǎn)而言之，PCR體系的要求就是“加對(duì)成分加對(duì)量”，就好比做一道菜，缺了任何一種材料或者量不合適，味道就不一樣了，而對(duì)PCR而言，缺了任何一種成分或者量不對(duì)，你就別想看到漂亮的目標(biāo)條帶了。所以配體系的時(shí)候一定要專心,不要分心思考類似于今天中午吃什么這種哲學(xué)問(wèn)題，注意所有的成分是否加對(duì)了，每種成分的量是否加對(duì)了。例如，酶的量很少，吸取的時(shí)候要注意有沒(méi)有吸到。

3.PCR擴(kuò)增
就擴(kuò)增而言，關(guān)鍵是要設(shè)計(jì)對(duì)程序，主要就是退火溫度及延伸時(shí)間。
退火溫度根據(jù)引物的Tm值而定，延伸時(shí)間按所用的酶來(lái)計(jì)算。

4.PCR產(chǎn)物電泳
終于到了令人激動(dòng)的時(shí)刻，擴(kuò)增好就可以進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳出結(jié)果了。當(dāng)然，在做之前你得提前把膠配好，膠的質(zhì)量好壞也會(huì)影響結(jié)果。這個(gè)環(huán)節(jié)需要注意的就是選擇合適的膠濃度，膠溶解加熱時(shí)不要過(guò)久，水分蒸發(fā)過(guò)多濃度改變，但同時(shí)要保證膠溶解徹底。添加的染液要注意檢查是否過(guò)期變質(zhì)。倒好膠后插梳子，注意除去氣泡，待膠凝固之后拔梳子要一氣呵成，然后給樣本加loading buffer，最后就可以上樣啦。

這一步我們要注意以下幾點(diǎn)：
可以每個(gè)孔加一點(diǎn)loading buffer檢測(cè)膠是否有漏。特別是當(dāng)你覺(jué)得膠可能破了的時(shí)候一定要進(jìn)行驗(yàn)漏；
上樣的時(shí)候槍頭垂直加入，不要戳破膠孔，邊加邊抽出，防止噴涌出來(lái)，注意不要有氣泡；
上一個(gè)樣換一個(gè)槍頭，防止污染；
電泳液多次使用的話，最好頻繁更換，防止污染。

5.設(shè)置對(duì)照組
生物實(shí)驗(yàn)一定要做對(duì)照，沒(méi)有對(duì)照就沒(méi)有說(shuō)服力，而且設(shè)置對(duì)照有利于分析PCR鑒定失敗的原因。陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照所加體系與待測(cè)樣本一樣，只是加的樣本分別為無(wú)菌水及同個(gè)品系野生型小鼠的基因組模板。

陰性對(duì)照的意義：若是陰性對(duì)照也P出了條帶，說(shuō)明有污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。
陽(yáng)性對(duì)照的意義：如果陽(yáng)性對(duì)照也沒(méi)P出來(lái)，說(shuō)明體系、條件或是操作有問(wèn)題。

接下來(lái)就給大家分析一下PCR的常見(jiàn)問(wèn)題以及改進(jìn)的建議，PCR成功的原因只有一個(gè)，而失敗的原因卻千千萬(wàn)，每個(gè)步驟都要細(xì)心謹(jǐn)慎，祝大家都能跑出漂亮的條帶。

PCR常見(jiàn)問(wèn)題及建議

1.沒(méi)有條帶

原因1.1 ：樣本。樣本放置太久失效；樣本裂解步驟出問(wèn)題，比如組織沒(méi)有浸沒(méi)到裂解液中；樣本有裂解到但是DNA濃度低，跟取樣有關(guān)，毛發(fā)太多組織太少，會(huì)導(dǎo)致裂解不出太多DNA。
建議：當(dāng)然是重新取樣提取DNA了，取樣大小適中，裂解時(shí)注意組織是否完全浸沒(méi)到裂解液中。

原因1.2： PCR反應(yīng)體系。少加酶、引物、dNTP、緩沖液等均會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)片段擴(kuò)增不出來(lái)。
建議：配體系加樣時(shí)，自行開(kāi)啟勿擾模式，心無(wú)雜念，心里默念：每種成分都加了嗎？量都加對(duì)了嗎？

原因1.3： 操作問(wèn)題。比如是否把酶放置在冰上，常溫放置過(guò)久會(huì)使酶失活；加各體系的時(shí)候，是否有吸取到再加進(jìn)去。
建議：記住冰在酶在，即使是融酶也要放冰上融，拿手握住酶或是常溫放置，被老板看見(jiàn)是要被打的。

2.抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。
原因：往往是由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差、dNTP濃度過(guò)高、Mg2+濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低、或循環(huán)次數(shù)過(guò)多及引物不特異等引起的。
建議：減少酶量或換另一來(lái)源的酶；減少dNTP的濃度；適當(dāng)降低Mg2+濃度；增加模板量；減少循環(huán)次數(shù)。最有效的方法就是提高退火溫度，或者更換引物（引物不特異也會(huì)造成抹帶）。

3.條帶比較暗

原因3.1：酶。
建議：條帶弱的情況加多酶量，一半都能得到改善。實(shí)驗(yàn)表明，PCR酶對(duì)DNA具有一定的偏好性，如果使用一種酶經(jīng)過(guò)優(yōu)化也難以獲得理想擴(kuò)增時(shí)，可以嘗試別的PCR酶。

原因3.2：模板、引物。
建議：確保模板和引物的品質(zhì)，保證沒(méi)有降解。用合適的試劑盒回收樣本，或者進(jìn)行膠回收得到純凈的DNA樣本是不錯(cuò)的選擇，或者直接加多模板，提高反應(yīng)體系中DNA的濃度。

原因3.3：反應(yīng)體系與條件
建議：增強(qiáng)循環(huán)數(shù)、降低退火溫度、適當(dāng)升高M(jìn)g2+工作濃度，都可以提高擴(kuò)增效率，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致特異性下降，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求優(yōu)化合適的條件。

PCR失敗的原因千千萬(wàn)，操作情況因人而異，所以實(shí)驗(yàn)小白們?cè)诓僮鲿r(shí)可以請(qǐng)師兄師姐幫忙看一下，他們會(huì)發(fā)現(xiàn)許多你都注意不到的操作錯(cuò)誤，及時(shí)糾正過(guò)來(lái)就好了，不然每次操作都出同樣的錯(cuò)誤，而自己又不知道錯(cuò)在哪，覺(jué)得自己是按著步驟和要求來(lái)做的啊，怎么就出問(wèn)題了，反復(fù)操作還是這樣，簡(jiǎn)直讓人懷疑人生。