神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法)操作步驟

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
上個(gè)世紀(jì)70年代，Kristensopn和Olsson報(bào)道了HRP可神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，經(jīng)組織化學(xué)方法可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而開發(fā)出HRP追蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù)，即為HRP法。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根過氧化物酶的常用底物，在辣根過氧化物酶的催化下,DAB會(huì)產(chǎn)生棕色沉淀，該棕色沉淀不溶于水和乙醇，顯色后呈棕色，可在顯微鏡下觀察。
神經(jīng)HRP示蹤顯色液(DAB法)是動(dòng)物經(jīng)麻醉、注入HRP后，游離或絡(luò)合型的HRP與氧化劑反應(yīng)生成絡(luò)合物，該絡(luò)合物氧化供氫的DAB顯色劑，呈棕色，在顯微鏡下清晰可見。該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。
產(chǎn)品組成：
 

名稱/編號(hào)	R0895	Storage
試劑(A):DABAssayBuffer	2×500ml	RT避光
試劑(B):DAB顯色液	30ml	-20℃避光
試劑(C):DAB增強(qiáng)劑	2×1ml	RT
試劑(D):DABWashBuffer(20×)	100ml	RT
使用說明書	1份

 
 
 
 
 
 
 
 

操作步驟(僅供參考):
(一)準(zhǔn)備工作
1、動(dòng)物麻醉：多用(3.5%)戊巴比妥鈉作為麻醉劑，大鼠的麻醉劑量為0.25～0.35ml/100g。
2、導(dǎo)入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的注射涂抹等法。
3、確定動(dòng)物存活期。
4、動(dòng)物灌注：麻醉后，經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管行心內(nèi)灌注固定，先用生理鹽水或PBS快速灌注；隨后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，時(shí)間控制在30-40min；最后用10%蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。
5、取材：取組織置于20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。
(二)顯色反應(yīng)
1、配制DAB孵育液：取適量的DABAssayBuffer和DAB顯色液，按DABAssayBuffer：
DAB顯色液=39:1的比例混合，即為DAB孵育液，即配即用，不宜保存。
2、配制DAB顯色工作液：取適量的DAB孵育液和DAB增強(qiáng)劑，按DAB孵育液：DAB增強(qiáng)劑=2000～8000：1的比例混合(具體比例應(yīng)根據(jù)具體時(shí)間摸索確定)，即為DAB顯色工作液，即配即用，不宜保存。
3、配制1×DABWashBuffer：取適量的DABWashBuffer(20×)，按DABWashBuffer：
蒸餾水=1:19的比例混合，即為1×DABWashBuffer；室溫保存，6月有效。
 4、切片用蒸餾水清洗3次，每次2min。
5、切片入10mlDAB孵育液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動(dòng)。
6、切片入10mlDAB顯色工作液(提前20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動(dòng)。
7、漂洗：取10ml左右的1×DABWashBuffer漂洗切片2～3次，每次5min。
8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣干燥。
9、脫水、透明步驟按如下操作：
①蒸餾水10s
②70%乙醇10s
③95%乙醇10s
④100%乙醇2次，每次10s
⑤二甲苯或脫蠟透明液透明2次，每次2～5min。
10、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察棕色反應(yīng)。
 
注意事項(xiàng):
1、如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀，表明DAB底物反應(yīng)過于強(qiáng)烈。
2、所用器皿必須潔凈，避免含有氧化劑或還原劑，否則會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
3、DAB顯色液避免反復(fù)凍融，以免顯色效率下降。
4、DAB增強(qiáng)劑注意密閉保存，否則顯色效率下降。
 
有效期:12個(gè)月有效