組織培養(yǎng)時(shí)各種滅菌特點(diǎn)

常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。

一、培養(yǎng)基用濕熱滅菌

培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。

注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。

關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。

到達(dá)保壓時(shí)間后，即可切斷電源，在壓力到0.5MPa，可緩慢放出蒸汽，應(yīng)注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當(dāng)壓力降到零后，才能開蓋，取出培養(yǎng)基，擺在平臺(tái)上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養(yǎng)基成分變化，以至培養(yǎng)基無法擺斜面。一旦放置過久，由于鍋爐內(nèi)有負(fù)壓，蓋子打不開，只要將放氣閥打開，大氣壓入，內(nèi)外壓力平衡，蓋子便易打開了。

對(duì)高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種工具，可以延長滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時(shí)間。

對(duì)于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30分鐘。

高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其PH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基PH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高PH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的PH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)PH值單位。環(huán)境PH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。

高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。

培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá)5%。

為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上訴一些變化可用下列方法：

1、經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，以便及時(shí)采取有效措施。

2、設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值對(duì)高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。

3、配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。

4、注意高壓滅菌后培養(yǎng)基PH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的PH值常由5.8升高至6.48。而96小時(shí)后又回降至5.8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。

二、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌

在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

三、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌

干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免防礙熱對(duì)流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。

四、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌

一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些微生物是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。

一些化學(xué)成分在高溫高壓下回發(fā)生降解而失去效能或降低效能。經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10%。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長的物質(zhì)。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。IAA、NAA、2，4-D、激動(dòng)素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，但如果培養(yǎng)基的PH值高于5.5，則維生素B1會(huì)被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會(huì)失去作用。