大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取實驗

實驗方法原理：

堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在堿性pH環(huán)境，DNA變性，當(dāng)恢復(fù)中性并在高鹽離子濃度時，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中；而線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，相互交聯(lián)纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得大量質(zhì)粒的上清液，利用親水性有機溶劑（乙醇、異丙-醇、PEG8000）使質(zhì)粒DNA脫水，離心后收集。

實驗材料 ：含質(zhì)粒的大腸桿菌

試劑、試劑盒：葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 異戊-醇

儀器、耗材：臺式高速離心機 恒溫振蕩搖床 高壓滅菌鍋 振蕩器 微量移液器 1.5ml離心管
一、試劑配制

1. LB液體培養(yǎng)基。

2. 100 mg/ml氨芐西林儲存液：稱取25g的氨芐西林粉末，加去離子水至250ml，完全溶解后過濾、分裝，20℃保存。

3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-鹽酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-鹽酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去離子水至500ml，高壓滅菌，貯存于4℃。

4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氫氧-化鈉溶液，1％ SDS（10 N 氫氧-化鈉20 μl，10％SDS 100μl，加去離子水至1ml），使用前臨時配制。

5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸鉀300ml，冰醋-酸57.5ml，加去離子水至500ml，4℃保存。

6. 苯-酚：氯-仿（1：1，V／V）（酚和氯-仿均有很強的腐蝕性操作時應(yīng)戴手套?。?。

7. 無水乙醇。

8. 70％乙醇。

9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解，然后在沸水煮

15min，分裝，20℃保存。

10. TE緩沖液：10 mmol/L Tris-鹽酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。

二、實驗方法

1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液體培養(yǎng)基中。37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜（約12——14h）。

2. 取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)液倒入離心管中，4℃、6000轉(zhuǎn)離心30s，棄上清，將離心管倒置于紙巾上，去除殘留液體。

3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，室溫下放置5 min。

4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管5——10次，以混勻內(nèi)容物，冰浴5min。

5. 加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，溫和顛倒5——10次混勻，冰浴3——5min，4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。轉(zhuǎn)移上清到一個新的1.5ml Ep管中。

6. 加入等體積的酚一氯-仿抽提劑，振蕩混勻，4℃、6000轉(zhuǎn)，離心2 rain。

7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍體積用冰預(yù)冷的無水乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA，混勻，室溫放置2--5rain，4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。

8. 棄上清，將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇，蓋緊離心管顛倒數(shù)次，4℃、6000轉(zhuǎn)，離心2min。

9. 去除所有的乙醇溶液，將管倒置于紙巾上使液體流盡，室溫干燥5——10min，直到乙醇都揮發(fā)干凈。

10.將質(zhì)粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液（含20 μg/ml RNaseA）中，溫和振蕩數(shù)秒，-20℃儲存?zhèn)溆谩?br>
注意事項：

1. 溶液Ⅰ與溶菌液充分搖勻，用力適當(dāng)。因為此時細(xì)菌還沒有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必?fù)?dān)心其分子斷裂，一般可用力振蕩幾次。

2. 加入SDS后則要注意不能過分用力振蕩，溫和混勻，但又必須讓它反應(yīng)充分。

3. 加入溶液Ⅱ混勻之后，一定要在冰上放置，不要搖動，對于溶液Ⅲ同樣處理。