實(shí)驗(yàn)室微生物樣品收集與保存攻略

如何在無(wú)缺失或多樣性改變的前提下保存實(shí)驗(yàn)室中的微生物樣品

過(guò)去十年間，科學(xué)家們花費(fèi)數(shù)十億美元完成了人體、土壤和海洋等不同地點(diǎn)的微生物的分類(lèi)歸總，通過(guò)日益精確的新一代測(cè)序技術(shù)，我們對(duì)這些差別甚大的微生物有了更多的認(rèn)識(shí)，比如說(shuō)，對(duì)細(xì)菌核糖體小亞基 16S rRNA 編碼基因進(jìn)行高通量測(cè)序，科學(xué)家們能了解樣品中的微生物多樣性。此外還可以選擇鳥(niǎo)槍宏基因組學(xué)作為互補(bǔ)技術(shù)，分析樣品中所有生物的所有基因。這些DNA測(cè)序技術(shù)十分敏感，也能識(shí)別樣品污染和危害樣品處理引發(fā)的細(xì)微變化。

由于處理和存儲(chǔ)樣品的變化會(huì)影響研究結(jié)果，因此要想維持在現(xiàn)場(chǎng)收集樣品的完整性也是微生物研究中的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。
來(lái)自Mayo醫(yī)院的微生物生態(tài)學(xué)家 Vanessa Hale表示，金標(biāo)準(zhǔn)方法是從新鮮樣本中立即提取DNA 或 RNA。當(dāng)不可能立即處理的時(shí)候，最好能將樣品儲(chǔ)存在?80°C。室溫下糞便樣品中的微生物組成會(huì)在一到兩天內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)變，其它樣品，如土壤也同樣具有溫度敏感性。

但是超低溫冰箱并不是隨取隨到的，也許糞便樣本首先在家里收集得到，或者研究人員需要從很遠(yuǎn)的地方收集土壤樣品。在一些情況下，樣品都需要存儲(chǔ)和保留幾天或幾周，才能進(jìn)行DNA和 RNA的提取和分析。

來(lái)自芝加哥大學(xué)的微生物生態(tài)學(xué)家 Jack Gilbert說(shuō)，“微生物多樣化多到可怕，而且復(fù)雜。任何特殊處理都會(huì)改變其組成部分?！辈贿^(guò)隨著技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)在可以進(jìn)行更多深入的微生物群落分析，即使是微生物菌群最小的變化或者相對(duì)豐度改變，也會(huì)極大的干擾群體比對(duì)，因此儲(chǔ)存方法引起的變化越小越好。以下是The Scientist雜志推薦的一些樣品保存技巧。

樣品均質(zhì)化

原始樣品的保真性從收集樣品的那一刻就開(kāi)始了。第一步需要確保你獲得的是一個(gè)均勻的樣品，“如果一個(gè)樣品不是均質(zhì)樣品，那么首先要使之均質(zhì)化，”來(lái)自比利時(shí)根特大學(xué)的微生物學(xué)家Kim Heylen說(shuō)，“如果你想要重復(fù)性好的樣品，那么（這樣做）至關(guān)重要。”

美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的微生物學(xué)家Holly Ganz在一家非盈利機(jī)構(gòu)KittyBiome進(jìn)行野貓和家貓的微生物組研究，他們一般采集野貓和家貓的糞便作為樣品，她說(shuō)，“糞便當(dāng)然不是均質(zhì)的，因此這就產(chǎn)生了一個(gè)問(wèn)題：采用哪一部分的糞便會(huì)影響研究結(jié)果。”

因此Ganz需要均質(zhì)化樣品，她首先去除了糞便的外層，這一部分可能包含有環(huán)境污染物，然后剩余部分放置到塑料袋中進(jìn)行人工碾磨和混合。之后Ganz又將樣品鋪開(kāi)，收集二次樣品，“要讓糞便樣品均質(zhì)化并不容易，所以我只好增加二次取樣的次數(shù)，”她說(shuō)。

2015年，一組研究人員完成了一項(xiàng)人腸道微生物組的研究，他們將液氮糞便樣品通過(guò)研缽及研杵搗碎，使之成為粉末狀小樣品，然后轉(zhuǎn)移到試管中，?80°C儲(chǔ)存。比較于之前的方法，這種制備樣品的方法能減少微生物組成上出現(xiàn)的可變性。