細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)檢測方法 @遠(yuǎn)慕實驗

    細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ?+和Mg?+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。
 
    一、過氧化物酶標(biāo)記測定法

    原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

    毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。

    本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測定。

    (一)試劑配制

    1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

    2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

    3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

    4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

    5、TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

    6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml

    7、0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。

    8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。

    9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

    10、   過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（ONCOR）

    （二）實驗步驟

    1、標(biāo)本預(yù)處理：

    （1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

    （2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

    （3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5 × 107個/ml細(xì)胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

    2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。

    3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

    4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。

    5、將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

    6、 組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。

    7、用PBS洗4次，每次5min。

    8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

    9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

    10、 于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

    11、 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

    （三）注意事項

    一定要設(shè)立陽性和陰性細(xì)胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標(biāo)本，陽性細(xì)胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。