纖維素酶活性測定的方法

纖維素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，是一種復合酶，作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產物。

纖維素酶的組成與功能

纖維素酶根據(jù)其催化反應功能的不同可分為內切葡萄糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），來自真菌的簡稱EG，來自細菌的簡稱Cen、外切葡萄糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），來自真菌的簡稱CBH，來自細菌的簡稱Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）簡稱BG。內切葡萄糖酶隨機切割纖維素多糖鏈內部的無定型區(qū)，產生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖產生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶產量高、活性大，在畜牧業(yè)和飼料工作中主要應用真菌來源的纖維素酶。

纖維素酶活性測定（3,5-二硝基水楊酸法）

實驗原理：纖維素酶水解纖維素，產生纖維二糖、葡萄糖等還原糖，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，利用比色法測定其還原物生成量來表示酶的活力。

實驗試劑：

1. 3,5-二硝基水楊酸顯色液：稱取10g 3,5-二硝基水楊酸，溶入蒸餾水中，加入20g分析純氫氧化鈉，200g酒石酸鉀鈉，加水500ml，升溫溶解后，加入重蒸酚2g，無水亞硫酸鈉0.5g。加熱攪拌，待全溶后冷卻，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。

2. 0.1摩爾pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

3. 0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液，溶解后成膠狀液，靜置過夜。使用前搖勻。

4.標準葡萄糖溶液：稱取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5.酶液：將0.05g酶溶解定容至50ml，從中取出1ml再定容至100ml，待測。（用pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制）

實驗器材：

1. 比色管10支。

2. 722型分光光度計。

3. 滴管。

4. 水浴鍋。

5. 移液槍。

6. 電爐。

實驗步驟：

1. 標準曲線的繪制：分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml的葡萄糖于5支比色管中，均用蒸餾水稀釋至1ml，加3.5-二硝基水楊酸顯色劑3ml，在沸水浴中煮沸顯色10分鐘，冷卻，加蒸餾水21ml，搖勻。以1ml蒸餾水代替糖作空白管，在550nm處比色。以光密度為縱坐標，以葡萄糖微g數(shù)為橫坐標，繪出標準曲線。

2. 空白管的測定:取1ml酶液，沸水浴5分鐘，冷卻加3ml0.5%CMC，與樣品管同時放入50度水浴30分鐘。其它操作同樣品管。

3. 樣品的測定：取0.5%羧甲基纖維素鈉溶液3ml，酶液1ml，于50度水浴中糖化30分鐘，取出，立即于沸水浴中煮沸10分鐘使酶失活，得糖化液，冷卻加入3ml顯色液，再沸水浴10分鐘，冷卻后加水定容至25ml，混勻，550nm測OD值。