動(dòng)物檢疫基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制方案簡(jiǎn)介

隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快和進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，世界各國(guó)人員往來、物資交流越來越頻繁，境外動(dòng)物疫病傳人我國(guó)的危險(xiǎn)性和可能性也隨之增大。據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織發(fā)表的公報(bào)報(bào)道，目前全球各種疾病中的60％來自動(dòng)物，在所有動(dòng)物引發(fā)的各種傳染病中，75％的疾病能傳染給人。在人類近現(xiàn)代史上，一些人畜共患病曾造成了巨大的災(zāi)難，如鼠疫、炭疽、SARS、禽流感等。不少人獸共患病都具有傳播快、死亡率高、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和整個(gè)社會(huì)的穩(wěn)定都產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響。所以，做好人畜共患病的監(jiān)測(cè)和快速篩選溯源工作，尤其是分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)．是保護(hù)人畜生命安全，應(yīng)對(duì)緊急疫情的發(fā)生和動(dòng)態(tài)的疫源地疫情監(jiān)測(cè)的有力手段。

核酸檢測(cè)技術(shù)是一大類依據(jù)分子生物學(xué)原理檢測(cè)DNA或RNA的技術(shù)，1985年聚合基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明標(biāo)志著它的誕生。經(jīng)過多年發(fā)展．核酸檢測(cè)技術(shù)已派生出包括恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和核酸雜交在內(nèi)的多種方法，在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域的病原體檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)致病菌需要準(zhǔn)確、可溯源的標(biāo)準(zhǔn)樣品用于檢測(cè)方法的研究、確認(rèn)和驗(yàn)證，核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品是分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)不可缺少的重要陽(yáng)性對(duì)照物和質(zhì)控物。因此．核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制是隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，最近十幾年才發(fā)展起來的一門新興產(chǎn)業(yè)。核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的關(guān)鍵技術(shù)主要包括大批量高純度核酸提取、核酸的準(zhǔn)確定值、冷凍干燥、均勻性和穩(wěn)定性分析、溯源性等。

第二節(jié) 動(dòng)物檢疫基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制方案簡(jiǎn)介

一、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

我國(guó)已經(jīng)研制出和動(dòng)物檢疫有關(guān)的致病菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品包括：金黃色葡萄球菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、阪崎腸桿菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、溶血性鏈球菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、肉毒梭菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、蠟樣芽孢桿菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、四種致病性大腸埃希氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、空腸彎曲菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、腸炎沙門氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、副溶血性弧菌I葺核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品等。

國(guó)際上已經(jīng)研制出和動(dòng)物檢疫有關(guān)的致病菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品包括：歐共體的參考物質(zhì)和測(cè)量研究所(IRMM)研制的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(IRMM- 447)、空腸彎曲菌基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(IRMM一448)、大腸埃希氏菌O157：H7基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(IRMM一449)。

二、制備基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的操作步驟

(一)茵株收集、鑒定和增茵培養(yǎng)

用相應(yīng)的方法對(duì)收集的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)和生化鑒定、血清凝集和特異性基因片段的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)．結(jié)果符合的則用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

(二)基固組DNA提取

4℃下離心收集培養(yǎng)好的菌液并用于DNA提取，基因組DNA提取可以用商業(yè)化的核酸提取試劑盒．如AB公司生產(chǎn)的PrepManTM Ultra或QIAGEN公司生產(chǎn)的Genmictips 500 /G和Genomic DNA Buffer Set。DNA提取物溶解在pH 8．0的TE緩沖液中，并在一20℃下保存?zhèn)渑蟆?/span>

用于制備基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)盡可能大，因此核酸提取過程中應(yīng)特別小心：首先，在抽提過程中，不可避免的機(jī)械剪切力必將切斷DNA，因此在提取過程中應(yīng)盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA分子的可能性；其次，分子熱運(yùn)動(dòng)也會(huì)減少所抽提到DNA的分子量，所以提取過程也應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行；最后．因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)及抽提器皿中污染的核酸酶也會(huì)降解制備過程中的DNA，所以制備過程使用的玻璃器皿、試劑，離心管等一次性用品都應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格的消毒滅菌．破壞核酸酶的活性。另外制備的基因組DNA必須是高純度的，因此制備的樣品必須沒有蛋白質(zhì)和RNA污染，各種離子濃度也應(yīng)符合要求，這些在基因組DNA制備時(shí)都應(yīng)考慮到。

(三)基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

1．基因組DNA濃度測(cè)定

以λ噬菌體DNA為外標(biāo)物。采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法測(cè)定提取的基因組DNA濃度。對(duì)于分析物濃度為50 ng／mL時(shí)，PicoGreen DNA分子熒光定量方法測(cè)量的變異系數(shù)CV=2．4％。PicoGreen DNA分子熒光定量檢測(cè)步驟為：

(1)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1)100μg /mL的x噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用pH 8.0的TE緩沖液稀釋成2 μg/mLDNA貯存液。

2)2μg /mL的x噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)品貯存液按表3-1進(jìn)行稀釋。

3)每個(gè)反應(yīng)孔按表3-1所示．再加入1 mLQuant—iTTM PicoGreen試劑，混勻，在室溫避光孵育2 min～5 min。

4)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。

(2)待測(cè)樣品檢測(cè)

1)取待測(cè)樣品溶液5 μL，用pH 8.0的TE緩沖液稀釋至1mL加入反應(yīng)孔中

2)每個(gè)反應(yīng)}L再加入1 mL Quant一iTTM PicoGreen試劑．混勻，在室溫避光孵育2 min～5 min。

3)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。

(3)反應(yīng)參數(shù)

多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)參數(shù)：激發(fā)光480 nm．發(fā)射光525 nm。

(4)結(jié)果計(jì)算

反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品扣除空白對(duì)照后的熒光值。以標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值為X坐標(biāo)軸，標(biāo)準(zhǔn)品的DNA濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣品中核酸DNA的熒光吸收值．從DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線上，得出待測(cè)樣品中DNA的濃度。

2．基因組DNA的質(zhì)量檢查

取10．0 μL DNA提取物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查．0．8％瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1．2％瓊脂糖凝膠)，在電壓為180 V條件下電泳30 min，電泳條帶如果清晰明亮、條帶單一、無雜帶和RNA，則說明提取的DNA質(zhì)量很好．核酸具有完整性和高分子量．可以用于核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品研制。

3．基因組DNA的分裝及冷凍干燥

將上述基因組DNA分裝于內(nèi)置微量管的樣品套管中，每管DNA含量為50μL，置于凍干機(jī)中冷凍干燥，如德國(guó)CHRIST公司生產(chǎn)的Christ Epsilon 2-85D凍干機(jī)(Chmt Ge-firertrocknungsanIagen GmbH，Osterode am Harz，DE)．使用儀器內(nèi)部程序ˊ15食品-PCR細(xì)菌DNA方法進(jìn)行凍于。凍干后的樣品在無菌條件下密封并加貼唯一性標(biāo)識(shí)，放置于-20℃中避光貯存。

來源：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)