動物檢疫基因組DNA標準樣品的研制方案簡介

隨著經(jīng)濟全球化進程的加快和進出口貿(mào)易的發(fā)展，世界各國人員往來、物資交流越來越頻繁，境外動物疫病傳人我國的危險性和可能性也隨之增大。據(jù)世界動物衛(wèi)生組織發(fā)表的公報報道，目前全球各種疾病中的60％來自動物，在所有動物引發(fā)的各種傳染病中，75％的疾病能傳染給人。在人類近現(xiàn)代史上，一些人畜共患病曾造成了巨大的災(zāi)難，如鼠疫、炭疽、SARS、禽流感等。不少人獸共患病都具有傳播快、死亡率高、危害嚴重等特點，對國民經(jīng)濟的發(fā)展和整個社會的穩(wěn)定都產(chǎn)生極其嚴重的影響。所以，做好人畜共患病的監(jiān)測和快速篩選溯源工作，尤其是分子生物學檢驗技術(shù)．是保護人畜生命安全，應(yīng)對緊急疫情的發(fā)生和動態(tài)的疫源地疫情監(jiān)測的有力手段。

核酸檢測技術(shù)是一大類依據(jù)分子生物學原理檢測DNA或RNA的技術(shù)，1985年聚合基鏈式反應(yīng)的發(fā)明標志著它的誕生。經(jīng)過多年發(fā)展．核酸檢測技術(shù)已派生出包括恒溫擴增技術(shù)和核酸雜交在內(nèi)的多種方法，在動物檢疫領(lǐng)域的病原體檢測中得到廣泛應(yīng)用。分子生物學技術(shù)檢測致病菌需要準確、可溯源的標準樣品用于檢測方法的研究、確認和驗證，核酸標準樣品是分子生物學檢驗技術(shù)不可缺少的重要陽性對照物和質(zhì)控物。因此．核酸標準樣品的研制是隨著分子生物學檢測技術(shù)的發(fā)展，最近十幾年才發(fā)展起來的一門新興產(chǎn)業(yè)。核酸標準樣品研制的關(guān)鍵技術(shù)主要包括大批量高純度核酸提取、核酸的準確定值、冷凍干燥、均勻性和穩(wěn)定性分析、溯源性等。

第二節(jié) 動物檢疫基因組DNA標準樣品的研制方案簡介

一、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

我國已經(jīng)研制出和動物檢疫有關(guān)的致病菌基因組DNA標準樣品包括：金黃色葡萄球菌核酸標準樣品、阪崎腸桿菌核酸標準樣品、溶血性鏈球菌核酸標準樣品、肉毒梭菌核酸標準樣品、產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸標準樣品、蠟樣芽孢桿菌核酸標準樣品、四種致病性大腸埃希氏菌核酸標準樣品、空腸彎曲菌核酸標準樣品、腸炎沙門氏菌核酸標準樣品、副溶血性弧菌I葺核酸標準樣品和單核細胞增生李斯特氏菌核酸標準樣品等。

國際上已經(jīng)研制出和動物檢疫有關(guān)的致病菌基因組DNA標準樣品包括：歐共體的參考物質(zhì)和測量研究所(IRMM)研制的單核細胞增生李斯特氏菌基因組核酸標準樣品(IRMM- 447)、空腸彎曲菌基因組核酸標準樣品(IRMM一448)、大腸埃希氏菌O157：H7基因組核酸標準樣品(IRMM一449)。

二、制備基因組DNA標準樣品的操作步驟

(一)茵株收集、鑒定和增茵培養(yǎng)

用相應(yīng)的方法對收集的標準菌株進行增菌培養(yǎng)和生化鑒定、血清凝集和特異性基因片段的PCR擴增實驗．結(jié)果符合的則用相應(yīng)的標準方法進行增菌培養(yǎng)。

(二)基固組DNA提取

4℃下離心收集培養(yǎng)好的菌液并用于DNA提取，基因組DNA提取可以用商業(yè)化的核酸提取試劑盒．如AB公司生產(chǎn)的PrepManTM Ultra或QIAGEN公司生產(chǎn)的Genmictips 500 /G和Genomic DNA Buffer Set。DNA提取物溶解在pH 8．0的TE緩沖液中，并在一20℃下保存?zhèn)渑蟆?/span>

用于制備基因組DNA標準樣品的DNA相對分子質(zhì)量應(yīng)盡可能大，因此核酸提取過程中應(yīng)特別小心：首先，在抽提過程中，不可避免的機械剪切力必將切斷DNA，因此在提取過程中應(yīng)盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA分子的可能性；其次，分子熱運動也會減少所抽提到DNA的分子量，所以提取過程也應(yīng)盡可能在低溫下進行；最后．因為細胞內(nèi)及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程使用的玻璃器皿、試劑，離心管等一次性用品都應(yīng)經(jīng)過嚴格的消毒滅菌．破壞核酸酶的活性。另外制備的基因組DNA必須是高純度的，因此制備的樣品必須沒有蛋白質(zhì)和RNA污染，各種離子濃度也應(yīng)符合要求，這些在基因組DNA制備時都應(yīng)考慮到。

(三)基因組DNA標準樣品制備

1．基因組DNA濃度測定

以λ噬菌體DNA為外標物。采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法測定提取的基因組DNA濃度。對于分析物濃度為50 ng／mL時，PicoGreen DNA分子熒光定量方法測量的變異系數(shù)CV=2．4％。PicoGreen DNA分子熒光定量檢測步驟為：

(1)DNA標準曲線制備

1)100μg /mL的x噬菌體DNA標準品，用pH 8.0的TE緩沖液稀釋成2 μg/mLDNA貯存液。

2)2μg /mL的x噬菌體DNA標準品貯存液按表3-1進行稀釋。

3)每個反應(yīng)孔按表3-1所示．再加入1 mLQuant—iTTM PicoGreen試劑，混勻，在室溫避光孵育2 min～5 min。

4)多功能酶標儀檢測。

(2)待測樣品檢測

1)取待測樣品溶液5 μL，用pH 8.0的TE緩沖液稀釋至1mL加入反應(yīng)孔中

2)每個反應(yīng)}L再加入1 mL Quant一iTTM PicoGreen試劑．混勻，在室溫避光孵育2 min～5 min。

3)多功能酶標儀檢測。

(3)反應(yīng)參數(shù)

多功能酶標儀檢測反應(yīng)參數(shù)：激發(fā)光480 nm．發(fā)射光525 nm。

(4)結(jié)果計算

反應(yīng)結(jié)束后，確認標準品和待測樣品扣除空白對照后的熒光值。以標準品的熒光值為X坐標軸，標準品的DNA濃度為縱坐標，制作標準曲線。根據(jù)待測樣品中核酸DNA的熒光吸收值．從DNA標準曲線上，得出待測樣品中DNA的濃度。

2．基因組DNA的質(zhì)量檢查

取10．0 μL DNA提取物和PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢查．0．8％瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產(chǎn)物用1．2％瓊脂糖凝膠)，在電壓為180 V條件下電泳30 min，電泳條帶如果清晰明亮、條帶單一、無雜帶和RNA，則說明提取的DNA質(zhì)量很好．核酸具有完整性和高分子量．可以用于核酸標準樣品研制。

3．基因組DNA的分裝及冷凍干燥

將上述基因組DNA分裝于內(nèi)置微量管的樣品套管中，每管DNA含量為50μL，置于凍干機中冷凍干燥，如德國CHRIST公司生產(chǎn)的Christ Epsilon 2-85D凍干機(Chmt Ge-firertrocknungsanIagen GmbH，Osterode am Harz，DE)．使用儀器內(nèi)部程序ˊ15食品-PCR細菌DNA方法進行凍于。凍干后的樣品在無菌條件下密封并加貼唯一性標識，放置于-20℃中避光貯存。

來源：北京標準物質(zhì)網(wǎng)