細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的血淚教訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)總結(jié),都是干貨喲!!!

    科幻電影中將凍存若干年的生命體重新解凍復(fù)活的情節(jié)在生命科學(xué)研究過程中每一天都在上演。為了將每一種有生命的細(xì)胞較好的保存其原有的細(xì)胞特性或者長(zhǎng)久的保存種質(zhì)資源，實(shí)驗(yàn)人員往往將細(xì)胞用特殊配置的細(xì)胞凍存液保存于-196℃ 的液氮，使得細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)，等到實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)候再?gòu)囊旱腥〕鰪?fù)蘇應(yīng)用。在這一看似神奇的生命存儲(chǔ)過程中，我們不禁要問，這是如何實(shí)現(xiàn)的呢？

    其實(shí)，細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的教科書和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上面都有。小編不想再重復(fù)了。這里，我要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧，大部分都是血淚教訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。都是干貨喲。

    1、冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好
    高大上的實(shí)驗(yàn)室可以使用程序冷凍儀。一切由機(jī)器代勞。屌絲實(shí)驗(yàn)室就只好用人肉程序冷凍儀。具體的 protocol，到處都有。小編想提醒大家的是，細(xì)胞冷凍越慢越好，寧慢勿快。做細(xì)胞冷凍前，事先留出充足的時(shí)間。
    而復(fù)蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來之后，迅速放在 37°C 水浴中，然后使勁搖呀搖。令其盡快融化。

    2、高高興興上班，平平安安回家
    細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面*容易出事的部分。凡是和液氮接觸的操作，注意戴保護(hù)眼鏡和手套。*需要小心的是：復(fù)蘇的時(shí)候，在水浴中搖呀搖的時(shí)候。有時(shí)候小瓶會(huì)爆炸的。所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套。不多說了，說多了滿眼都是淚。還有，解凍之后，應(yīng)不應(yīng)該去除凍存液中的 DMSO 呢？答案是 Yes。為了保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，解凍后的細(xì)胞首先都要經(jīng)過離心，去除 DMSO 之后再加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng) 24 h 之后換液，以完全除去培養(yǎng)基中的 DMSO。當(dāng)然了，如果你買遠(yuǎn)慕的無毒凍存液，就不存在這個(gè)問題啦。

    3、凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠
    無論再怎么小心，細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過程中總會(huì)死掉一批的。所以，一開始凍存細(xì)胞的數(shù)量要足夠。一般要達(dá)到 5×106/毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個(gè)不能一概而論。有些細(xì)胞，比如雜交瘤細(xì)胞，只需要 1-3x106/毫升。

    4、做好標(biāo)記
    把培養(yǎng)瓶放入提手，末端應(yīng)該扎有小牌，注明主人的名字，細(xì)胞名稱和凍存日期。還要在每個(gè)凍存管上寫上細(xì)胞名稱，代數(shù)和凍存日期。
    實(shí)驗(yàn)室的液氮罐都是公用的。每個(gè)人應(yīng)該有屬于自己的提手。小編當(dāng)年就發(fā)生過為了找自己的細(xì)胞，被迫把整個(gè)液氮罐翻了個(gè)底朝天的慘劇。

    5、細(xì)心呵護(hù)
    剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞就象剛剛出生的 baby，非常脆弱。需要我們的細(xì)心呵護(hù)。培養(yǎng)液要事先在培養(yǎng)箱或者水浴中復(fù)溫。一切的和細(xì)胞接觸的動(dòng)作都要輕柔。把細(xì)胞從凍存管里吸出來，注入離心管，要輕輕地吸取和滴加。包括給離心管補(bǔ)加培養(yǎng)液的時(shí)候，都要輕輕地滴加。離心要用低速離心（500-1000 轉(zhuǎn)/分鐘）。吹打要用專用的吹打管，而不要圖方便用移液槍，吹打也要輕輕的。

    6、DMSO 的問題
    那么，解凍之后，應(yīng)不應(yīng)該去除凍存液中的 DMSO 呢？答案是 no。除了極少數(shù)特別注明的對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外，99% 的細(xì)胞都不需要去除 DMSO。解凍后的頻繁換液會(huì)慢慢去除掉 DMSO 的。當(dāng)然了，如果你買微科的無毒凍存液，就不存在這個(gè)問題啦。

    7、物離鄉(xiāng)貴，人離鄉(xiāng)賤
    解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)基和血清，培養(yǎng)基的選擇非常重要，目前國(guó)內(nèi)血清市場(chǎng)假貨泛濫，這里小編也推薦一下上海遠(yuǎn)慕的，正品行貨有保證。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長(zhǎng)環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)基和血清，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡。這和一個(gè)人突然離家千里，會(huì)水土不服是一樣的道理。