免疫組化正確姿勢中的四個細節(jié)!!

董太師門下的弟子最近耗費大量元神得了一批老鼠，又跑去他族求得一批圣物——人類標本，本以為離飛升上仙僅一步之遙，卻在忙活了數(shù)天、耗費了三魂三魄，在 DAB 顯色液滴在載玻片上的 N 剎那后，聽到了自四海八荒傳來的轟轟天雷——切片上的臘肉竟然毫無反應！

弟子此次的天劫驚到了正在閉關(guān)的董太師，他放下正在研讀的他山典籍《CNS》，走出山洞，細細端詳了一番，緩緩說道：「你只學到了這門功夫的『形』，但『神』還缺些火候，現(xiàn)下，為師將把組化大法中需要提升的四個細節(jié)一一滴渡給你：

免疫組化正確姿勢中的四個細節(jié)

1. 標本固定——不僅僅是「切一切」和「泡一泡」

溫柔地取材：大刀闊斧取材的同時，視組織如珍寶，莫擠壓組織，輕柔取材和鑷取。盡量避開壞死區(qū)域。太大太厚的組織不利于均勻一致的固定，實質(zhì)組織取材厚度應小于 5 mm。

新鮮的固定液： 固定液 10% 中性緩沖福爾馬林 (NBF) 需新鮮配置，商用型固定液注意其標注的有效期，避免使用過期變質(zhì)的固定液。

充分及時地固定：固定液要充足，其與組織的體積比最好大于等于 20 倍；取材后即刻固定。固定時需將瓶口封住，避免甲醛揮發(fā)。組織的固定時間不宜過長，一般過夜（12～24 h）即可。

2. 修復大法——不僅僅是「煮一煮」

微波爐修復：簡單易行效果好，CST 推薦使用微波爐完成修復。

合適的修復液：根據(jù)抗體說明書使用合適的修復液。用檸檬酸修復后，切片需浸泡在修復液中，自然冷卻；而用 EDTA 修復后，切片可直接從修復缸中取出，直接進行下一步。

注：使用不同的修復方式和不同生產(chǎn)商的抗體檢測人肺癌組織中 EGFR 的表達。第一排為 CST 的 EGF Receptor (D38B1) XP^? Rabbit mAb（#4267），EDTA 的修復方式明顯優(yōu)于檸檬酸鹽及胃蛋白酶，故在該抗體說明書中，標注了使用 EDTA 修復進行免疫組化實驗。

3. 對的抗體，對的使用——不僅僅是「買買買和加加加」種屬和應用范圍：確定該抗體可檢測所需種屬（Reactivity）的石蠟切片上完成組化實驗（Application： IHC-P）。

稀釋液和稀釋比：查看抗體說明書，使用正確的一抗稀釋液和稀釋比。

注：與#4060 在 TBST/5% NGS 中稀釋后所得的信號強度相比，經(jīng) SignalStain^? 抗體稀釋液稀釋后的信號強度更強；而對于#4407，選擇 TBST/5% NGS 作為抗體稀釋液的效果更好。

4. 匹配的二抗和顯色系統(tǒng)——「配一配和滴一滴」

使用多聚 HRP（Poly-HRP）的二抗，即在二抗上連接大量 HRP，以充分放大信號；同時，配合優(yōu)質(zhì)的色原產(chǎn)品，提升靈敏度，增強信號。

注：在人肺癌標本中使用 Sox2(D6D9) XP^? RabbitmAb#3579 檢測 Sox2 的表達，使用基于多聚-HRP 的 SignalStain^? BoostIHCDetectionReagent 的檢測靈敏度更高。

注：DAB 色原比較：在人乳腺癌組織中使用 p-Stat3(Tyr705)(D3A7)XP^? Rabbit mAb#9145 檢測 p-Stat3 的表達，使用不同的產(chǎn)品進行顯色。與競爭者的 DAB 產(chǎn)生的信號相比，SignalStain^? DABSubstrateKit 的顯色強度更佳。

CST 對實驗細節(jié)進行了步步優(yōu)化，抗體說明書也是為實驗成功保駕護航的必備指南：

注：使用 PLK1(208 G4)Rabbit mAb #4513 檢測人結(jié)腸腫瘤中 PLK1 的表達，在經(jīng)過輔助試劑的步步優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，使用一抗稀釋液#8112 稀釋抗體，聚合物型二抗#8114 進行檢測，DAB 顯色試劑#8059 后，可以檢出 PLK1 的陽性表達。

編后記

免疫組化的實驗步驟雖然較為簡單，但是貴在精通，重在認真，要在細節(jié)，不忘 Protocol，方得 Result。