細胞復蘇過程按此步驟操作,原理來也可以如此傲嬌

【材料】

1.  常規(guī)細胞培養(yǎng)儀器設備恒溫水浴振蕩器。
2.  培養(yǎng)液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）

【操作程序】

1.  細胞實驗室進行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。
2.  培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。
3.  二甲基亞砜（DMSO)在40℃冰箱中冷藏30min，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5.  將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。
6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，調(diào)整細胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.  記錄復蘇日期

復蘇細胞的注意事項，這個真的很重要，一不小心就會造成小尷尬：

 1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

 2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產(chǎn)品。

3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4.  關于離心問題大約為2種說法：一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液；這種不需要離心，主要是怕離心不當造成細胞損失嚴重；第二種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體全倒凈，且一定倒干凈。按照常規(guī)的離心分裝的方法進行復蘇。

5.  細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在有些經(jīng)驗總結(jié)為培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附。

6.  復蘇細胞分裝的問題：試驗中復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。

7.  加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長， DMSO的濃度在小于0.5%- 1％都是沒有問題的。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。