遠(yuǎn)慕生物詳解：細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)答

1、加到培養(yǎng)基中的血清 必須滅活嗎？
 

答：不是必須的，看做什么實(shí)驗(yàn)了。
 

2、四季青胎牛血清滅活是56 ℃30分鐘嗎？
 

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長(zhǎng)因子 。但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，血清是需要滅活，一般是56 ℃，30 min。
 

3、我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？
 

答：進(jìn)口的一般都已滅活，國(guó)產(chǎn)的不一定，最好還是滅活一下再用較安全。

4、我用病毒上清轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體 ，是不是會(huì)影響轉(zhuǎn)染？我想未滅活的血清中含些抗體 補(bǔ)體可能會(huì)和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染，正確嗎？細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67 收集的病毒上清。為什么要用無(wú)血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)，目的是什么？
 

答：血清一定要滅活，可以先用無(wú)血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)以后再加血清。避免雜蛋白對(duì)病毒和宿主結(jié)合過(guò)程的干擾，一般是2-6小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活！這要根據(jù)實(shí)際情況而定，如果沒(méi)有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個(gè)小時(shí)。

5、(1)我買的是杭州四季青的新生牛血清，要滅活嗎？有些說(shuō)法是需要，有些說(shuō)直接解凍后就可以加入到培養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶 液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？
 

答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭(zhēng)議的話題。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來(lái)執(zhí)行，因?yàn)橛袃蓚€(gè)作用，第一是滅活補(bǔ)體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒(méi)有考慮熱處理對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子 、氨基酸 等成分帶來(lái)的負(fù)面影響。
 

我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時(shí)候，有一次水浴 箱在滅活過(guò)程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80 ℃，血清變成了凝膠狀，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對(duì)比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56 ℃下滅活半小時(shí)以上，肯定也會(huì)對(duì)里面的蛋白起到破壞作用。下次有機(jī)會(huì)我做個(gè)延長(zhǎng)滅活時(shí)間的實(shí)驗(yàn)試試，看看到底有多大的影響。熱滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會(huì)有沉淀產(chǎn)生，這常常會(huì)被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲(chóng)污染。為了驗(yàn)證到底有沒(méi)有污染，常常又會(huì)把血清放置37 ℃溫育，但是血清中的蛋白會(huì)進(jìn)一步析出，最后還是要做鏡檢，無(wú)菌培養(yǎng)試驗(yàn)，和革蘭氏染色試驗(yàn)，非常麻煩。
 

我看過(guò)一份資料，里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45 ℃到62 ℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。有人比較過(guò)11個(gè)不同細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6 個(gè)細(xì)胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細(xì)胞，MRC-5)的生長(zhǎng)帶來(lái)負(fù)面影響，三個(gè)細(xì)胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個(gè)細(xì)胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細(xì)胞生長(zhǎng)有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。
 

你可以摸索一下，血清從-20 ℃冰箱拿出來(lái)之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活，比較這兩種血清對(duì)細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個(gè)過(guò)程最多也就一個(gè)星期。同時(shí)你還要考慮血清滅活與否對(duì)你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒(méi)有影響。
 

(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見(jiàn)血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？
 

答：正常。

 

6、如何選用培養(yǎng)基？
 

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊讀uanMEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的首xuan是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。

 

 

7、為什么要熱滅活血清？
 

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。  

 

8、L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？  
 

L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

 

9、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？  
 

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。

 

10、為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？  
 

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

 

11、如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？  
 

用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2 000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

 

12、如何消除組織培養(yǎng)的污染？
 

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

1） 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2 ）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

3 ）每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4 ）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。

5 ）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6 ）重復(fù)步驟4。

7 ）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代，確定污染是否以已被消除。

 

13、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？  
 

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

 

14、為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀？  
 

GIBICO的胎牛血清 沒(méi)有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2－8 ℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在－20 ℃儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。

 

15、目錄上說(shuō)，Hank's 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO₂培養(yǎng)箱。原因是什么？ Hank's 平衡鹽溶液（HBS）和Earle's平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？  
 

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO₂平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO₂ 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO₂培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO₂培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。

 

16、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
 

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)： End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌體檢驗(yàn) 生物化學(xué)檢測(cè)  激素的檢測(cè) 血紅蛋白檢測(cè) Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)

 

17、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？  
 

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

 

18、制備 lipid-DNA的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎？  
 

是的。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100 μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對(duì)于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒(méi)有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800 μl）。（注意以上是35 mm培養(yǎng)皿使用體積）。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來(lái)可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。對(duì)于每一種脂質(zhì)體的詳細(xì)的信息可以參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

 

19、我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效guo好？  
 

如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的唯yi底物是你的目的蛋白。為了避免這一問(wèn)題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

 

20、如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平？  
 

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過(guò)修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。 胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在Grand Island，按照手冊(cè)上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前，用無(wú)熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過(guò)程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）  

 

21、我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？  
 

如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。

 

22、20 ℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎？  
 

對(duì)于普通使用的緩沖液，pH值隨溫度變化而變化。 下表列出溫度改變10 ℃時(shí)，pH值的變化情況 例如 20 ℃下配制pH7.4 Tris緩沖液,40 ℃時(shí)pH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78 

 

 

23、室溫下(25 ℃)配制的Tris-HCl溶液，在37 ℃使用時(shí)PH值是多少？
 

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50 mM Tris-HC 溶液在4 ℃，25 ℃，37 ℃時(shí)，不同的PH值。

 

 

24、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少？  
 

生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類昆蟲(chóng)細(xì)胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲(chóng)細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345－380 mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

 

25、High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎？  
 

High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。