細胞傳代培養(yǎng)過程中的原則、注意事項

  在生物醫(yī)學(xué)實驗中常常會用到細胞系，指原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。也指可長期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細胞。細胞系是經(jīng)過細胞傳代或續(xù)代培養(yǎng)是將細胞從現(xiàn)有的培養(yǎng)物分開或分出來開始新的培養(yǎng)，并加入新鮮培養(yǎng)液來促進擴增的常用手段。但是細胞系與新分離的或原代細胞的培養(yǎng)條件相類似，但也有一些基本不同的地方：

（1）每個細胞系需要其特定的生長因子混合物

（2）與原代細胞相比，它們的生長需要更嚴(yán)密的監(jiān)測，因為使它們無限生長的突變同時也會造成它們很快達到過度生長。因此，當(dāng)細胞系生長到了幾乎覆蓋整個培養(yǎng)器皿底部，也就是90%的密度時，細胞需要重懸洗滌用于實驗或凍存以備將來使用，或者重新接種到新的培養(yǎng)器皿進一步擴增。

細胞傳代的基本原則
代謝的有毒物質(zhì)會隨時間在細胞培養(yǎng)液中累積。當(dāng)擴增細胞時，尤為重要的是經(jīng)常更換培養(yǎng)液以維持細胞健康和監(jiān)測細胞擴增情況以避免細胞生長過度。傳代的細胞通常分為兩個主要類型：永生化細胞系和干細胞系。永生化細胞系是那些來自多細胞生物的細胞通過一些突變修飾改變了細胞周期調(diào)控從而可以無限繁殖的細胞。最著名的永生化細胞系也許是HeLa細胞系，它是1951年取自于Henrietta Lacks女士取樣活檢的宮頸癌病變組織。與腫瘤永生化的細胞系相反，干細胞系通常從成人和胚胎組織的可自我更新的多能細胞中分離得到。這些細胞, 如您在短片中看到的人類胚胎干細胞 , 在適當(dāng)?shù)臈l件下也能無限傳代培養(yǎng)。細胞在優(yōu)化條件下可以懸浮培養(yǎng)，如從血液中分離到的永生化細胞, 或者貼壁培養(yǎng)，如許多從組織中分離的細胞系。貼壁細胞的生長必須仔細監(jiān)測以確保細胞保持健康。根據(jù)細胞類型，很多貼壁細胞在其達到70-90%密度，也就是覆蓋了培養(yǎng)容器表面的70-90%時需要傳代。這些細胞系雖然保留了原細胞源的很多特征，但是每次傳代也會使它們開始產(chǎn)生一些擴增細胞的特有特性。因此，對任何一個特定細胞系，要考慮限制傳代的次數(shù)。傳代細胞時，使用無菌技術(shù)和合適的試劑及設(shè)備尤為重要。針對細胞系選擇合適的培養(yǎng)液來得到最jia的生長和擴增很關(guān)鍵。每一個細胞系都有特定的生長營養(yǎng)組分配方，但是大多數(shù)細胞系起碼需要的添加物有以下這些：血清，如胎牛血清，需熱處理滅活其胎牛成分，它為細胞生長提供重要的生長因子?？股兀缜嗝顾睾玩溍顾赜糜诜乐辜毎廴?。其他的生長因子，如成纖維細胞生長因子，有助于延長細胞系的生長和擴增。不使用時，要將這些添加物或者“完全”細胞培養(yǎng)液保存于4攝氏度。

細胞換液注意事項：

首先要注意細胞培養(yǎng)液的顏色，富含營養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)液由于添加了pH指示劑酚紅故為透明橙色。當(dāng)細胞耗盡培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分時，開始在培養(yǎng)物中積累廢物和酸性物質(zhì)，降低pH值。因此，許多細胞培養(yǎng)液含有酚紅，當(dāng)培養(yǎng)物呈酸性時會將培養(yǎng)液顏色由橙色變?yōu)辄S色。培養(yǎng)液需在變黃之前更換。當(dāng)酚紅變?yōu)榉奂t色時，說明培養(yǎng)基pH偏堿，不利于細胞健康生長。這時可能需要改變二氧化碳濃度并更換培養(yǎng)液。很多貼壁細胞系可天然附著于無涂層的塑料上。因此，塑料細胞培養(yǎng)板如培養(yǎng)皿或六孔板經(jīng)常用于傳代細胞。塑料的細胞培養(yǎng)瓶也經(jīng)常用到，如T25的細胞培養(yǎng)瓶，常用于擴增培養(yǎng)數(shù)目少的細胞或者開始培養(yǎng)生長緩慢的細胞系。T75細胞培養(yǎng)瓶常用在培養(yǎng)擴增速度較快的細胞系或用于生長超過T25培養(yǎng)瓶容量的大量細胞。在轉(zhuǎn)移貼壁細胞時，要先剪切掉細胞上與和塑料結(jié)合的蛋白。因此，消化酶胰酶常用于消化細胞。控制胰酶消化的時間很重要，因為如果處理時間過長會損壞細胞表面的蛋白。細胞培養(yǎng)液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸緩沖液或PBS洗滌細胞。EDTA，一種鈣螯合劑有時候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。為擴增細胞克隆，將新鮮傳代的細胞培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱中，選擇適合該細胞生長條件，通常為溫度37度，二氧化碳5％和濕度95%。

細胞傳代的操作步驟

首先，重要的是要清楚細胞需要監(jiān)測的頻繁程度，這取決于該細胞的擴增速度?，F(xiàn)在培養(yǎng)液為亮橙色，再觀察其它生長情況。如培養(yǎng)液是否渾濁-如渾濁則可能有污染, 細胞的大小和密度以及細胞的總體質(zhì)量。如果細胞密度達到90%，吸去細胞培養(yǎng)液，用無鈣離子和鎂離子的磷酸緩沖液洗滌。然后加入胰酶，置于37攝氏度約5分鐘，確認(rèn)細胞脫壁后，加入新鮮細胞培養(yǎng)液終止胰酶的水解。將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移到錐形管離心。細胞離心下來后，小心棄去上清，重懸細胞于新鮮培養(yǎng)液。計數(shù)收集到的細胞然后根據(jù)合適密度接種細胞立即進行擴增或用于將來擴增。

傳代的不同應(yīng)用：

前面已經(jīng)提到，人胚胎干細胞是一類必須傳代的細胞。它們通常與小鼠成纖維細胞MEF共培養(yǎng)，后者能提供幫助干細胞保持其多能性的因子。生長于飼養(yǎng)細胞上的干細胞到了合適的發(fā)育階段時需挑出來?？捎梦⑿鸵埔汗芴舫龌蛴貌ＡЧぞ咻p輕將其刮下然后接種于新的培養(yǎng)液中進行擴增。有一些細胞系對酶消化敏感，或者貼壁很緊無法使用胰酶處理來重懸。細胞刮常用來輕輕將細胞從培養(yǎng)板的底部刮下來。如果細胞貼壁特別緊，可加入培養(yǎng)液或適當(dāng)溶液后用血清吸管用力刮擦。使用該方法時要小心，細胞比較脆弱，容易在這種機械剝離的方法中受損。為了更快并可重復(fù)性的大量擴增細胞到超過單層培養(yǎng)瓶容量的規(guī)模，可以使用多層培養(yǎng)瓶，它的培養(yǎng)量可達單層培養(yǎng)瓶的3-5倍。